微生物大实验——土壤中芽孢杆菌
的分离及鉴定实验报告
学 院：生命科学学院 专 业：生物技术 班 级： 组 数: 学 号: 姓 名:
前言
芽孢杆菌是能形成芽孢 (内生孢子) 的杆菌。芽孢是休眠体，不是繁殖体。绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内, 由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。核心是芽孢的原生质体，内含DNA 、RNA 、可能与 DNA 相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。芽孢杆菌属是大的(4–10um), 革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢杆菌属可分为以下亚群：多粘芽孢杆菌、枯草杆菌（包括蜡样杆菌和地衣芽孢杆菌）、短芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌。芽孢杆菌是一种耐高温、高压及低PH 值的有益微生物，本实验从土壤中分离出15株芽孢杆菌，从中挑选出一株芽孢杆菌进行生理生化鉴定，以及分子鉴定。通过进一步的实验，了解到其生理生化特点。
一、实验目的：
掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
二、实验原理：
芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
三、实验仪器材料：
1、仪器：显微镜、培养皿、试管、三角瓶、烧杯、移液管、涂布棒、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱、电泳仪、PCR 仪、提取DNA 试剂盒
2、材料：培养基：LB 培养基、淀粉培养基、孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH 溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇、硝酸盐、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖
四、实验步骤：
（一）、菌种的分离和纯化
1、取样
2、LB 培养基的配制：1L 水、10g 蛋白胨、5g 牛肉膏、10g Nacl、15g 琼脂、120℃灭菌30分钟待用
3、平板及斜面的制备
4、制备土壤菌悬液：称取土样约1g 土壤放入盛有9ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上150r/min,振荡10min 。使土样与水充分混合，使细胞分散。用一支1ml 无菌吸光吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1 稀释液，以此类推制成10-2，10-3………..10-6等几种稀释度的土壤溶液。
5、涂布：用无菌吸管分别吸取每个梯度0.2ml 的土壤溶液，准确放入PDA
平板中，用无菌玻璃涂棒在培养及表面轻轻地涂布，使溶液分布均匀。室温下静置5-10min 。
6、培养：将平板置于28℃温箱培养1-2天。选择单个菌落挑取少量的菌苔，接种于斜面上。
7、纯化：挑取单菌落溶于无菌水中，充分震荡摇匀，接种于已灭菌的LB 培养基的平板上。
8、初染：将纯化后得到的菌株进行革兰氏染色，并从中挑选出呈紫色的菌株，纯化保种并进行形态学、生理生化及分子鉴定
（二）形态观察：
1、个体形态特征观察 2、群体形态特征观察
（三）芽孢杆菌鉴定的生理生化试验
1、好氧性试验
细菌对氧气的需求是细菌鉴定的重要指标之一。若在培养基中加入还原剂，如巯基醋酸钠和甲醛次硫酸钠，可除去培养基中的氧气或氧化型的物质，使厌氧菌能在有氧条件下生长。 （1）培养基
a 、胰胨20g K2HPO4 1.5g NaCl 2.5g 巯基醋酸钠0.6g 美蓝0.002g Na2SO3 0.2g L-胱氨酸0.4g 蒸馏水 1000mL 琼脂0.5g
pH7.2，分装试管（装量约1/2试管），0.1MPa 、121℃灭菌15min 。 b 、酪素水解物20g NaCl 5g 巯基醋酸钠2g 甲醛次硫酸钠1g 琼脂15g 蒸馏水 1000mL
pH7.2，分装试管（装量约1/2试管），0.1MPa 、121℃灭菌20min ，培养基不搁斜面。 （2）试验方法
取一环（接种环外径1.5mm ）肉汤培养液，穿刺接种到上述培养基底部，30℃培养3d 至7d 观察结果。好氧菌在培养基上部生长，厌氧菌则在培养基底部生
长。
2、糖发酵试验（木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇）
糖类发酵产酸是细菌分类鉴定的一项重要依据。 （1）培养基
(NH4)2HPO4 1gMgSO4·7H200.2g KCl 0.2g 酵母膏0.2g 糖或醇类10g 水洗琼脂 5~6g蒸馏水 1000mL 0.04%溴甲酚紫（或溴百里酚蓝）酒精液20mL
pH7.0~7.2，分装10×100mm 小试管，培养基高度3~4cm，0.05MPa ，110℃灭菌20min 。 （2）试验方法
取培养18~24h的菌种，直针穿刺接种到培养基中，适温培养1、2、4、7、14d 后观察结果。指示剂由紫色变黄（溴百里酚蓝由绿变黄），表示发酵糖类产酸，琼脂柱中出现气泡，则表示产气。
3、M.R 试验（甲基红试验）
M.R 试验和V.P 试验分别测试细菌产酸和产生中性物质的能力。有的利用葡萄糖产酸，使PH 值低于4.2，并可维持4d 以上。甲基红阴性的细菌可将产生的酸进一步代谢，在4d 内生成中性化合物。因此，观察时间对于该项试验非常重要，一般细菌以4d 观察为宜。如果细菌在4d 期间M.R 和V.P 反应均为阳性，则应该培养较长的时间，以确定生成的酸是否已完全转变。 （1）培养基
蛋白胨5g 葡萄糖5gNaCl 5g 蒸馏水1000mL
调节pH 至7.0~7.2,分装试管，每管4~5mL，0.05MPa ，110℃灭菌20min 。 （2）试剂
甲基红0.1g95%酒精300mL 蒸馏水200mL （3）方法
将菌种接种到上述培养基中，适温培养4、6d 。在培养基中加入几滴甲基红试剂，若培养基显红色，则为甲基红阳性，黄色，则为阴性。如为阴性，可适当
延长培养时间。
4、淀粉水解试验
许多芽孢杆菌都能产生淀粉酶，可将培养基中的淀粉水解为糊精等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
（1）培养基
牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g 淀粉2g
琼脂20g 水 1000mL
pH7.2~7.4，分装三角瓶，0.1MPa ，121℃灭菌20min 。
（2）方法
将培养基熔化并冷却至50℃，倒平板，待冷却凝固后，取菌种点种于培养基上，每皿可点种3~5个菌株，适温培养2~4d，待长出菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以刚好铺满整个平板为宜。若菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。
5、硝酸盐还原试验
有的细菌可将培养基中的NO3－还原为NO2－、NH3和N2等，硝酸盐还原作用的反应式如下：
2H 2H
HNO3 HNO2 HNO H2NOH NH3＋H2O
H2O ＋N2O
H2O ＋N2
须注意反应过程中，NO3－可能是最终产物，也可能是中间产物。如NO3－被还原为NO2－，加入格里斯试剂则培养基呈粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色。
（1）培养基
牛肉膏蛋白胨液体培养基 1000mL KNO3 1g pH7.0~7.4，0.1MPa ，121℃灭菌30min 。
（2）试剂 a 、格里斯试剂
A 液：对氨基苯磺酸0.5g10%稀醋酸150mL
B 液：α—萘胺0.1g 蒸馏水 20mL 10%稀醋酸150mL
b 、二苯胺试剂
称取0.5g 二苯胺溶解于100mL 浓H2SO4中，用20mL 蒸馏水稀释。
（3）方法
将试验菌种接种于培养基中（须做不接种的对照管），适温培养1、3、5d ，取两支洁净的试管，倒如少许培养液，然后在其中分别各加一滴A 液和B 液，对照管加入同样的试剂。如培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色时，表示有NO2－存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则进一步加入1~2滴二苯胺试剂，如培养液呈蓝色，则表示培养基中仍存在NO3－，如培养液不显蓝色，则表示NO3－和新形成的NO2－均已还原成其他物质，仍按硝酸盐还原阳性记录。
6、耐盐性试验（2、5、7%NaCl）
该项试验可检测渗透压对细菌生长的影响。不同的细菌对盐的耐受性不同，可作为鉴别性特征之一。 （1）培养基
在牛肉膏蛋白胨液体培养基中分别加入2、5、7、10%的NaCl 。 （2）方法
将幼龄菌制成菌悬液，然后直针接种到培养基中，适温培养3~7d，与未接种的对照管对比，目测生长情况。注意培养基要求必须十分澄清。
（3）实验结果：
形态观察：
4、生理生化鉴定结果
（四）分子鉴定
五、实验总结：
好淀M
氧粉性
实水
验 解 R
枯草芽孢杆菌
+ + + + + + + + + — — +
阴
性
20号土壤菌
+ + + + + 无法确定
+ + — — + ：
—
耐盐性实验 5%
7% 硝酸盐利用实验 葡萄糖利用 甘木阳
露糖性醇
利利
用 用 ：
阿拉伯糖利用