广东药学院
机能实验第四室1组 临床医学10（3）班
组员：黎楚杏 袁汝康 刘伟珍 苏彩凤
神经内环境PH值对蛙坐骨神经-腓肠肌标本收缩的影响
【实验目的】神经内环境PH值对蛙坐骨神经-腓肠肌标本收缩的影响
【实验原理】
1、离体的神经—腓肠肌肉标本在一定条件下，能保持其特有的生理特征。经查阅现阶段我们的教材与实验设计中是都是测定不同刺激强度和刺激频率对肌肉收缩能力的影响。而内环境PH值的变化是否对肌肉收缩也产生很大影响，在现目前的实验教材中并无太多介绍，对此的研究也不是很多。本设计实验主要通过不同PH值的任氏液对肌肉收缩产生的影响。
2.、蛙类动物内环境的PH值在6.5—7.0之间，内环境PH值的的改变会神经传导纤维上Na+--K+通道蛋白的活性，从而Na+、K+进出细胞的量会减少。Na+内流的减少会影响动作电位0期除极化，使得动作电位幅度也相应下降，即动作电位的上升支相比正常动作电位时的上升支会比较低。由于动作电位的下降支是由钾离子外流所致，所以当钾外流降低时，动作电位的下降支没有下降到正常值，造成动作电位的异常。而电位复极化的不完全导致传导至神经-肌接头神经纤维动作电位异常，影响接头前膜去极化，使电压门控钙通道开放异常，Ga2+进入神经末梢减少，突触囊泡与接头前膜融合不足、乙酰胆碱释放减少，乙酰胆碱结合并激活Ach受体通道异常，Ach被胆碱酯酶分解异常，使得终板膜对Na+、Ka+的通透性发生改变，最终导致肌膜动作电位异常，因此影响肌肉的收缩功能。通过观察肌肉的收缩功能的变化来反应内环境PH值的变化对神经活性的影响
【实验对象】
蛙
【实验器材及材料】
18只青蛙、蛙类常用手术器械，张力换能器，肌动器（肌槽），Medlab生物信号采集处理系统，铁架台，双凹夹，任氏液，PH计，浓盐酸（氯化氢的质量分数在38%左右），NaOH固体，10ml滴量管，容量瓶（100ml）、小烧杯，玻璃棒，蒸馏水，天平，棉线等。
【实验方法】
一，药物的配置：、
1、配置浓度为2%HCl溶液
用10ml滴量管吸取浓盐酸溶液5.25ml滴加在100ml的容量瓶，再滴加蒸馏水至90ml左右，用玻璃棒搅拌使之混匀，再用胶头滴管吸取蒸馏水滴加至100ml刻度处
2、2%NaOH溶液
用天平称取2gNaOH固体，置于100ml的容量瓶中，再加入蒸馏水90ml左右，用玻璃棒搅拌是NaOH固体溶解，再用胶头滴管滴加蒸馏水至容量瓶100ml刻度处
3、配置PH值不同的任氏液
1）校整PH计，先将“PH—mv”开关拨到PH位置。打开电源开关预热30min，用滤纸拭去PH计玻璃电极上多余的水分，在小烧杯内加入蒸馏水至一半的位置，将电极浸入。将量程开关拧到0—7或7—14处，调节控温钮指示的温度与室温一致，调节零点，是指针指在PH=7处，重复校整后，将
电极拭干，待用
2）酸性任氏液：用10ml的滴量管吸取5ml 2%的HCl溶液的置于小烧杯，再加入5ml的任氏母液，用PH计边测边滴加任氏母液，分别配置PH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的任氏液分别置于6个干净的小烧杯中（注意：每次使用PH计时必须将其电极用蒸馏水冲洗干净，用滤纸拭干）
3）碱性任氏液：配置方法与酸性任氏液一样，配置PH值为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的任氏液，分别置于5个干净的小烧杯杯
4）中性的任氏液：配置PH为7.0的任氏液，方法如上，置于一个干净的小烧杯中。
二、制备具有生物活性的蛙坐骨神经-腓肠肌标本36个，过程如下：
）蟾蜍的双毁髓
①取青蛙一只，用自来水冲洗干净。
②左手握住青蛙，用食指按压其头部前端，拇指按压 背部，右手持毁髓针于枕骨大孔刺入颅腔，左右搅动充分捣毁脑组织。
③将探针抽回至进针处，再向后刺入脊椎管，反复抽插捣毁脊髓。
如果青蛙四肢松软，呼吸消失，表明脑和脊髓已完全破坏，否则应按上法反复进行。
2）剥制后肢标本
①在骶髂关节水平以上1cm处剪断脊柱，左手握住青蛙后肢，用拇指压住骶骨，使青蛙头与内脏自然下垂，右手持普通剪刀，沿脊柱两侧剪除一切内脏及头胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及脊柱两侧的坐骨神经。
②剪除过程中注意勿损伤坐骨神经。
③握紧脊柱断端（注意不要握住神经），右手握住其上的皮肤边缘，向下剥掉全部后肢皮肤。把标本放盛有任氏液的培养皿中。将手及部手术器械洗净，进行下面步骤。
3）分离两后肢
①用镊子夹住脊柱将标本提起，背面朝上。
②沿正中线用剪刀将脊柱和耻骨联合中央辟开两侧大腿，完全分离。
③两后肢浸入任氏液的培养皿中，备用。
4）游离坐骨神经
标本腹面朝上，脊柱旁游离坐骨神经，并穿线结扎。
将标本背面朝上，把梨状肌及其附近的结缔组织剪去。
循坐骨神经沟（股二头肌与半膜肌之间的裂缝处），找出坐骨神经的大腿段。 用玻璃针剥离，从脊柱根部将坐骨神经的所有分支游离。
5）游离腓肠肌
在腓肠肌跟肌腱下穿线结扎，提起结线，游离腓肠肌。
6）分离股骨头
将游离干净的坐骨神经搭于腓肠肌上，在膝关节周围剪掉全部大腿肌肉，并用普通剪刀将股骨刮干净，保留1cm股骨头并剪断股骨。
提起结线，剪去膝关节下部的后肢。
7）检查标本兴奋性
8）用经任氏液润湿的锌铜弓轻轻接触一下坐骨神经，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，则表明标本的兴奋性良好，即可将标本放在盛有任氏液的培养皿中，以备实验用。
三、标本的分组编号及浸泡
将已制备好的活性标本随机分为12组，编号为1—12组，分别将标本的神经部分置于对应PH为1.0、2.0......12.0的任氏液中，各浸泡15min后备用，期间向肌肉部分不断滴加任氏母液以保持其生物活性。 四：实验装置及仪器连接和观察
1、连接好Medlab生物信号采集处理系统、张力换能器，将蛙坐骨神经-腓肠肌标本置于肌槽上
2、刺激模式为单刺激或主周期刺激，逐步增大刺激幅度，找出刚能引起肌肉出现微小收缩的阈 刺激强度，然后用一个中等强度刺激，记录肌肉的收缩状况，刺激参数与第三步一致
3、在刺激坐骨神经的同时把另外接坐骨神经的电刺激器连接于第2或第4通道上，启动Medlad生物信号采集处理系统，点击Medlad菜单“实验/常用生理学实验”，依次选择“神经干动作电位”，设置参数如下：
显示方式：记忆示波；采样间隔：25us；X轴显示压缩比：2:1；Y轴显示压缩比：4:1；放大倍数：通道2（200—1000）；通道4（200—1000）。
刺激模式：自动幅度调节；主周期：1s；波宽：0.1ms；初幅度：0.2V；增量：0.02V；
末幅度：1V；脉冲数：1；延时：5ms。
点击Medlad菜单“实验/常用生理学”，选择“刺激频率对骨骼肌收缩的影响”，设置参数如下： 放大倍数：通道1（50—100）；通道3（5—50）
刺激模式：自动频率调节；串长：1s；波宽：2ms；幅度：阈刺激以上一个中等大小的刺激强度；首频率：1HZ；增量：10HZ；末频率：45HZ；串间隔：3s.
4、首先用泡在PH为7.0的标本按照以上方法进行实验，每组重复进行3次，完成每组的实验后，肌槽需用蒸馏水冲洗3遍用滤纸拭干。其他组的标本依此方法进行。
观察项目
1、
2、 观察在第2步中两个刺激强度下神经干双相动作电位波形，并记录下动作电位的变化。 测定动作电位传导速度：
（1） 给予神经干中等刺激强度，在通道2、4的采样窗中，可观察到先后形成的两个双相动作
电位波形。
（2） 分别测量从刺激伪迹到两个动作电位起始点的时间，设通道2为t1，通道4为t2，求出
t2-t1的时间差值。
（3） 测量标本屏蔽盒中两对引导电极各第一个电极（）之间的距离“S”。
（4） 根据速度公式：V=S/t，计算出该神经干神经冲动的传导速度。
【预期结果】
1、刺激神经内环境为7.0的标本，其腓肠肌收缩的幅度最大，神经干双相动作电位波形的峰值最高，神经干神经冲动的传导速度最快
2、在神经内环境PH为1.0—7.0的标本中，随着PH值的增大，其腓肠肌收缩的幅度随之增大，神经干双相动作电位波形的峰值随之增高，神经干神经冲动的传导速度随之增快；在神经内环境PH为8.0—12.0的标本中，随着PH值的增大，其腓肠肌收缩的幅度随之下降，神经干双相动作电位波形的峰值随之下降，神经干神经冲动的传导速度随之减慢。
3、有可能在PH为1.0以及为12.0附近值时，腓肠肌收缩的幅度及神经干双相动作电位波形均为平的，神经干神经冲动的传导速度为0，可能是此时的神经纤维已经失活。
【注意事项】
1、 操作过程中，勿污染、压榨、损伤、过度牵拉神经和肌肉。
2、经常给肌肉上滴加任氏母液，防止表面干燥，以保持其正常兴奋性。
完整的标本包含四个部分：椎骨、坐骨神经、股骨、腓肠肌
3、标本的棉线与张力换能器连接时，不宜过紧或过松。 【参考资料】
1、《内蒙古民族大学学报》2000年第02期的《灌流液PH值对离体蟾蜍心脏心率和心输出量的影响》之灌流液PH的配置 作者：安会江,商战平,宋葆华）
2、.朱大年 吴博威 樊小力 《生理学》第七版
3、王建红 董艳芬 陈伟强 《医学技能学实验》第2版
指导老师：汪胜