山东大学实验报告 2011年4月6日
姓名张行润系年级2009级生科4班学号[1**********]7同组者于潜 科目生物化学实验题目唾液淀粉酶的最适PH测定仪器编号105
一． 实验目的
1、 了解pH对酶活力的影响
2、 了解什么叫最适pH，掌握测量pH对酶活力影响的基本原理和方法
二． 实验原理
影响酶反应活力的因素很多，影响胞外酶的因素主要包括PH值、温度和金属离子、抑制剂及其他小分子，以及酶浓度等因素。
PH值对酶反应活力的影响：
1、 酸或碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶的活力丧失，这种丧失活力可以是可逆的或者是不可逆的，对可逆的来说，改变PH值后可使活力恢复。
2、 酸或碱影响酶的活性部位催化基团的离解状态，使得底物不能分解成产物。
3、 酸或碱影响酶的活性部位结合基团的离解状态，使得底物不能和它结合。
4、 酸或碱影响底物的离解状态，或使底物不能和酶结合。
由于上述种种原因，各种酶的作用都有一个最适合的PH值范围。
最适pH 酶的催化活性与pH环境有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活力最高时的pH，称为酶的最适pH。高于或低于此pH时酶的活性逐渐降低。
用酶活力对PH值作图，往往是钟罩形曲线。最适合的PH值还随着底物浓度、温度和其他条件的变化而变化，因此确定最适合的PH值应在所实验的条件下测得。
需要注意的是：
1. 酶的最适pH不是一个特征性常数。不同种类的酶其最适合的PH值范围不同；
2. 同一种酶，来源不同，其最适合的PH值也有差异；
3. 同一种酶由于作用底物不同，酶最适合的PH值也不同；
4. 同一种酶作用于同一底物，随着温度等条件变化，最适合的PH值也有变化。如唾液淀粉酶最适pH为6.8，但在磷酸缓冲溶液中，其最适pH为6.4—6.6，而在乙酸缓冲溶液中则为5.6。总之，不同的酶在不同的PH值范围不仅稳定性不同，而且活力也不同，在最适合的PH值内活力最强，这是酶的一个重要特征，要仔细控制。
三． 实验器材
电热恒温水浴锅，旋涡混合仪，电炉，电子秤，试管10支，试管架，100mL容量瓶，小烧杯，移液管（1mL，2mL，5mL，10mL），三角瓶7个，胶头滴管，玻璃棒，白瓷板，洗耳球
四． 实验材料
1. 0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液100ml（新鲜配制）：称取0.30gNaCl溶于80mL水中，电炉加热煮沸，加入0.50g淀粉溶解至澄清透明，冷却，定容至100mL
2. 0.2mol/L Na2HPO4溶液 200ml
3. 0.1mol/L柠檬酸溶液 100ml
4. 不同浓度的唾液淀粉酶（1：100，1：200，1：400···）
5. 碘液
五． 实验步骤
1、 不同PH缓冲液的配制：
2、 唾液的获取：
蒸馏水漱口后在口中含蒸馏水，适宜时间后将蒸馏水连同唾液一同放置于事先准备好的容器中即可，在实验过程中应注意酶的失活，为了防止此现象发生应将此液体置于冰水中冷却；
3、 确定最佳保温时间：
取3支洁净试管，分别加入0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液2 mL，然后加入PH6.8的 Na2HPO4—柠檬酸缓冲溶液3 mL，分别加入稀释不同倍数的唾液淀粉酶各2 mL，充分摇匀后，放入37℃水浴中保温并计时，每隔1min用滴管取1滴混合液于点滴板上，加1滴碘液，检验淀粉水解程度，为橙黄色时，为水解完全，为进一步确定保温时间，应加1滴碘液至试管中，若为橙黄色时表示反应完全，记录所需保温时间。最佳保温时间应在8—12min左右，若偏差太大，应该加以稀释，因此要掌握好唾液淀粉酶的稀释浓度。
4、测定唾液淀粉酶的最适PH：
取7支干净试管，编号后分别加入0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液2 mL，然后分别加入第一步中配制的PH5.4-8.0的 Na2HPO4—柠檬酸缓冲溶液3 mL，37℃恒温水浴10min后，先往4号试管中加入2ml稀释过的唾液，摇匀后并开始计时，此后每隔1min向下一个试管中加入2ml稀释后的唾液并摇匀，均放入37℃恒温水浴中，待各试管均加入唾液后，等计时到达最佳保温时间，将4号试管取出并滴入一滴碘液，混匀后观察颜色变化，此后每隔一分钟按刚才加入唾液的顺序将试管依次取出，均加入一滴碘液，混匀后观察颜色变化，并做记录。所加试剂如下表所示：
六． 注意事项
1、 摸准保温时间是实验的关键，用滴管取保温液前后，均应将试管内的溶液混匀，取出保温液后，滴管仍放回试管中一起保温，以减少实验误差。
2、碘液不要过早的加到白瓷板上，以免碘液挥发，影响显色效果。
3、加入碘液后，立即摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，才能得到理想效果。
4、依照分子量算所需溶质质量的时候因结晶水的不同应按试剂瓶标签上的计算。
七． 实验结果
颜色由深到浅，再到深，最适pH6.8，颜
色最浅，近似焦黄色。如下图所示：
八． 分析讨论
在本实验中，最佳保温时间是关键。此
外，碘液的浓度也直接关系着实验结果的准
确观察，若本实验中配制的碘液浓度相对而
言比较高，碘液的颜色将实际反应的颜色遮
蔽，导致实验结果不能准确观察，为解决该
问题，可将碘液稀释后使用，从而得到清晰
的颜色梯度。
本实验中可能导致结果误差的原因有：
1. 在确定保温时间时未将滴管一起保温，导
致实验误差；
2. 在配制不同PH缓冲液和测定唾液淀粉酶
最适PH中加入试剂时若未混匀，将对实
验结果造成一定影响；
3.
碘液过早的滴加到白瓷板上会导致碘液
的挥发，可能会影响实验结果。 图1：唾液淀粉酶的最适PH结果图 （从左到右为1-7号试管） 从左到右依次是Na2HPO4—柠檬酸缓冲溶液PH5.4-8.0所配置的溶液，从左到右颜
色先变浅后变深，其中5.4的颜色最深，因
为偏酸性对唾液淀粉酶的酶活影响更大一些，
PH6.8的试管中颜色最浅，由此可得出人的唾
液淀粉酶的最适PH为6.8