【摘要】基因诊断是利用分子遗传学技术在DNA或RNA水平上对某一基因进行突变分析，从而对特定疾病进行诊断。基因诊断因其直接诊断性、高特异性、灵敏性、早期诊断性弥补了表型诊断的不足而被广泛应用。本文主要从基因诊断方法如核酸分子杂交、聚合酶链反应及相关技术、DNA序列测定、DNA芯片、连锁分析等在单基因遗传病中的应用进行综述。 【关键词】基因诊断；单基因遗传病；分子诊断；血友病 1基因诊断 基因诊断(gene diagnosis)又称DNA诊断或分子诊断，通过从体内提取样本用基因检测方法直接检测基因结构及其表达水平的改变，检测病原体基因型，进而判断是否有基因异常或携带病原微生物，或利用分子生物学技术从DNA水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷。应用基因诊断技术可以针对已确诊或拟诊遗传性疾病的患者及其家系成员，根据遗传学的基本原理，通过分子生物学的实验手段检查被检个体相关基因的异常，确定隐形携带者状态及在症状出现前的疾病易感性等，从而达到临床确诊的目的。因此，基因诊断迅速在临床诊断领域特别在遗传病研究领域得到了较为广泛的应用。目前的基因诊断方法主要有核酸分子杂交、聚合酶链反应及相关技术、DNA序列测定、DNA芯片、连锁分析等。 2单基因遗传病 单基因遗传病是指由单个基因异常导致且以孟德尔方式遗传的疾病，是我国常见出生缺陷的重要原因之一，较为常见且研究较多的有血友病、苯丙酮尿症(PKU)、肝豆状核变性、地中海贫血等等。除部分单基因遗传病可通过手术加以矫正外，绝大部分遗传病是致死、致残、致畸性疾病，且目前均无法治疗，进行遗传性疾病的产前诊断，是避免致死、致残、致畸性疾病胎儿出生的重要手段。 3基因诊断的应用 3.1在B型血友病中的应用 血友病B(hemophilia B)是因凝血因子Ⅸ(FlX)基因缺陷引起的x-连锁隐性遗传出血性疾病，在男性中的发病率约为1／30000，散发率可达患者总数的30％-50％[1]由于目前还不能根治，对于携带者和高危胎儿进行基因诊断非常必要。血友病B基因缺陷类型十分繁多，基因缺陷包括缺失、插入和点突变，其中80％左右为单个碱基突变[2]。目前已发现的突变位点中，除了导致氨基酸序列改变的突变外，还发现不少的CpG区、剪切位点的突变[3]。常用于血友病B连锁分析的方法有限制性片段多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)和短串联重复序列分析，但在中国人群中具有多态性的酶切位点很少。王学锋等[4]利用这6个短串联重复序列（STR）位点对8个血友病B家系进行连锁分析，诊断率达到99.99％。王莉等[5]在研究家系1和家系2中，发现分别有2个和3个位点可以提供信息，结果支持2例胎儿均未获得风险染色体，这与突变分析结果一致。连锁分析适于有家族史的血友病B或无家族史但携带者明确的产前诊断，且实验操作和结果分析相对简单，适用临床开展应用，是一种快速和有效的基因诊断方法 3.2在地中海贫血中的应用 地中海贫血是一组常染色体隐性遗传病。它是由于珠蛋白基因突变，使珠蛋白生物合成受阻、产量不足或缺如所致。地中海贫血常见有两种类型：α-地中海贫血和β-地中海贫血。β -地中海贫血是由于β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白链合成障碍的慢性溶血性贫血。β珠蛋白基因位于11号染色体短臂(1lpl5)。绝大多数β-地中海贫血是由于基因发生点突变所致，少数为基因缺失所致。突变基因特异型扩增系统(amplification refractory mutation system)法能快速鉴别诊断β-地中海贫血，简便可靠，可用于中国人非缺失型地中海贫血的基因诊断和产前诊断，便于基层单位应用。α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血在我国则以南方地区多见，如广西、广东、四川、云南等地。由于大部分α-地中海贫血是由于α-基因缺失所致，因此可运用基因诊断法对α-基因进行检查，针对α-地中海贫血的诊断具有重大的现实意义。基因诊断的探测目的物至少包括DNA和mRNA。Mullis建立PCR技术，多年来，这种技术在实际运用中发挥了重要的作用，为遗传病的诊断提供了更加可靠的依据。PCR是利用DNA聚合酶等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。Southern杂交是研究DNA图谱的基本技术，在分析PCR产物和遗传疾病诊断分析等方面有重要价值，它被认为是分析α珠蛋白基因缺陷的金标准。根据每个突变位点的特异扩增带来判断结果，在诊断各种缺失型α-地中海贫血时便于临床推广[6]。 文婕等[7]引进简便、快速的多重PCR技术、PCR-RFLP方法和PCR-RDB法，可准确地进行地中海贫血基因诊断。用于地贫高危胎儿的产前诊断中，对预防重型患儿出生有较好的临床价值。从112例疑似地贫的患者中检出α-珠蛋白基因突变和β-珠蛋白基因突变患者共59例,研究表明，α-地贫95％以上为缺失型，其分子基础主要是α-珠蛋白基因大片段缺失。限制性片段长度多态性(RFLP) 连锁分析法[8]是用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并电泳分离，从而检测地贫基因。基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上，采用荧光标记及引物延伸的方法，可提高检测结果的敏感性和特异性，由于基因芯片高通量特点，可将α、β地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成，适用于大面积普查[9]。 3.3在苯丙酮尿症中的应用 苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是儿科常见的氨基酸代谢病，因苯丙氨酸羟化酶基因突变导致PAH活性降低或丧失，过量苯丙氨酸和旁路代谢产物的神经毒性作用造成患儿严重智能障碍和继发性癫痫。国内外普遍开展的新生儿疾病筛查是诊断PKU的有效方法，而基因诊断较之生化筛查方法的优势在于能从DNA 水平了解病因，诊断特异性高，在个体发育的任何阶段，任何有核细胞都可以进行诊断，同时也为产前诊断和潜在新治疗方法的研究提供依据。Sudha Kohli等[10]采用该多态标记对一例PKU家系进行分析，结果先证者遗传了来自母亲的致病的等位基因１，而胎儿则遗传了来自母亲的正常的等位基因２，从而对胎儿作出了确诊。宋�等［11］利用测序技术检测了北方地区230例PKU患儿PAH 基因全部外显子，发现75种不同的突变（94.6％），其中３种为新发现位点。基因诊断结果可能预知PKU的病情轻重程度，指导临床分类和治疗［12］。 3.4在肝豆状核变性中的应用 肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson's disease，WD)，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病。WD为目前少数可以治疗的神经遗传病之一，患者如果能在发病早期或症状前期即被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之，病情逐渐加重甚至危及生命[13]。虽然典型的WD患者根据特征性临床表现及实验室铜代谢检查等不难诊断，但许多患者早期症状复杂多样，极易被误诊为其他疾病[14]，铜代谢检查又存在假阴性或假阳性结果[15]，因此，本病的早期诊断特别是症状前期和产前诊断较为困难。近年来，伴随基因组计划出现和发展起来的DNA微阵列技术以其固有的小型化、并行性和高通量等特点，在生物分子信息获取，特别是生物基因组的再测序、基因多态性的信息检测和基因表达监测等方面得到了快速的发展和应用。DNA微阵列技术与WD基因高度遗传异质性的特点相契合，是一种极具潜力的WD基因检测工具。2003年，Baner等[16]采用等位基因特异性封闭探针(allele-specific padlock probes)结合DNA微阵列技术对75例欧美裔WD患者13个基因突变及多态位点进行检测，经DNA测，序结果证实其准确率达100％。首次证实了该技术用于WD基因诊断的可行性。Harmut等开发了一种可以检测60种WD基因突变的DNA微阵列芯片，但仍不能包含一些少见的和新发现的突变[17]。因此，该技术目前尚处于研究探索阶段，加之建立DNA微阵列技术平台投入不菲，其面向临床应用尚需待以时日。
4结语 随着“人类基因组计划”的完成和“后基因组计划”的实施(即是对基因功能的研究和基因与人体疾病关系的研究)，分子生物学技术将会越来越普及、方便地运用到基因诊断领域。现代生物科学和其他学科技术的不断发展和完善，在不久的将来，即可把所有的基因都固定于1块芯片上时，就成了一块多基因疾病检测的万能芯片，它可适用于任何多基因疾病的检测，为临床检测工作带来极大的便利。总之，分子生物学和分子遗传学的飞速发展必将极大的促进基因诊断技术的进步。有理由相信，以基因诊断为基础的基因治疗必将成为人类治疗自身疾病的主流技术，并极大地促进人类卫生事业的进步。 参考文献 [1] Mukherjee S，Mukhopadhyay A，Chaudhuri K．el a1．Analysis of haemophilia B database and strategies for identification of common point mutations in the factor IX gene．Haemophilia，2003，9：187-192． [2] Carmen E，Pilar C，Satumino H，et al，Molecular anMyms in hemophilia B families：identification of six new mutations in factor IX gene．Haematologiea，2003，88：235-236． [3] Tagariello G，Belvini D，Salviato R，el a1．The Italian haemophilia B mutation database：n tool for genetic counselling，carrier deteetion and prenatal diagnosis Rosanna Di Gaelano．Blood Transfus，2007，5：158-163． [4] 王学锋，刘元肪，刘湘帆，等．血友病的携带者与产前分子诊断．中华检验医学杂志，2003，26：540-542． [5] 王莉，廖世秀，王应太等，应用两种方法对血友病B家系进行产前基因诊断[J]. 中华血液学杂志2010，31(3)：192-195. [6] Baig SM．Molecular diagnosis of beta-thalassemia by mul-tiplex ARMS-PCR：a cost effective method for developing count ries 1ike Pakistan[J]．Prenat Diagn，2007，27(6)：580. [7] 文婕，朱宝生，刘培玲等，９例地中海贫血患者的基因诊断研究[J],中国产前诊断杂志.2009,11:9-14 [8] Zeren F．Preliminary Data on Preimplantation Genetic Diagnosis for Hemoglobinopathies in Turkey[J]．Hemoglobin. 2007，31(2)：273． [9] Bang-Ce Y，Hongqiong L．Zhuanfong Z，et a1．Simultaneous detection of alpha-thalassemia and beta-thalassemiaby oligonucleotide microarray [J]．Haematologica，2004，89(8)：101． [10] Kohli S，Saxena R，Thomas E，et al．Prenatal diagnosis of phenylketonuria[J]. Indian J Med,2005,122:400-403 [11] 宋�，瞿宇晋，杨艳玲，等．中国北方地区苯丙氨酸羟化酶基因的突变构成[J]．中华医学遗传学杂志，2007,24:241-246. [12] 瞿宇晋，宋�．苯酮尿症的分子研究及其基因型-表型相关性的研究进展[J]．国际儿科学杂志，2006,1:23-26． [13] Ala A，Walker AP，Ashkan K，et a1．Wilson's disease．Lancet，2007，369：397-408． [14 ]胡纪源，吕达平，王共强，等．肝豆状核变性的临床误诊研究．中华医学杂志，2001，81(11)：642-644． [15] Roberts EA. Schilsky ML．A practice guideline on Wilson's disease．Hepatology，2003，37(6)：l475-l492． [16] Baner J，Isaksson A，Waldenstrom E，et a1．Parallel gene analysis with allele-specific padlock probes and tag microarrays．Nucleic Acids Res，2003，31(17)：103-109． [17] Harmut H，Schmidt J．Introducing single-nucleotide polymorphism markers in the diagnosis of Wilson disease．Clin Chem，2007，53(9)：1568-1569．