中国雇擘通报２００９，２５（０５）：１０－１３
ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎ
黄粉虫不同生长阶段诱导抗菌肽的效果分析
王立新，王姗姗，戴四发，路振香，王全虎，胡静
（安徽科技学院动物科学学院，安徽风阳２３３１００）
摘要：分析黄粉虫不同生长阶段所提取的抗菌肽抗菌活性及抗茵肽组分差异。通过针刺使黄粉虫各虫态感染大肠杆菌产生抗茵肤，经过研磨、离心等步骤提取抗茵肽，用药敏试验检测这些抗茵肽的抗茵效果，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳试验分离其蛋白及多肽条带。药敏试验的结果表明处于蛹期和成虫期的黄粉虫所产生抗菌肽的抑菌效果不如处于幼虫期所产生抗菌肽的抑茵效果明显，但差异不显著；电泳图谱显示黄粉虫动虫有８条带，成虫有５条，蛹有５条，说明黄粉虫蛹期和成虫的抗茵肽种类较幼虫期的少，但是它们都还有更多的小肽段来被分离开。关键词：黄粉虫；Ｏｒ导；抗茵肽中图分类号：Ｓ１８６文献标识码：Ａ
ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌＰｅｐｔｉｄｅｏｆ
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黄粉虫（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ，ｎｏｌｉｔｏｒ），别名黄粉甲，俗称面包虫。生活史经历卵一幼虫一蛹一成虫四个阶段，通常一年可发生１～２代。在适宜的温湿度条件下可发生２～３代，世代重叠，无越冬现象，属于完全变态。黄粉虫不仅是生理学、遗传学的试验材料，而且是营养丰富的高蛋白质资源。
抗菌肽（Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉｃａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ）是由２０～５０多个氨
基酸残基组成的小肽，其分子质量多不足２５～３０
ｋＤａｔ”。
抗菌肽具有分子量小、热稳定性强、水溶性好、强碱性、抗菌谱广、不破坏正常细胞的特点，在抗菌、抗病毒及抑瘤方面具有重要作用。是一类具有巨大发展潜力的新型高效低毒的肽类新药，是目前抗ｊ芮原微生物药物开发研究中的一个热点，有望成为新的抗菌制剂０１。昆虫体内抗菌肷合成的速度非常快，是机体理想的第
基金项目：安徽省高校自然科学基金重点项目“黄粉虫抗茵肽的诱导、提取、分离纯化及抗菌活性研究”（Ｋ．１２００７Ａ０９４）。
第～作者简介：王立新，男，１９６３年１０月生，副教授，研究方向资源昆虫利用。通信地址：２３３１００安徽风阳东华路９号、安徽科技学院动物科学院。Ｔｅｌ：０５５０．６７３８４５６，Ｅ．ｍａｉｌ；ｗａｎｇｌｉｘｉｎ＿＠１６３．ｃｏｍ收稿日期：２００８．１１－０６，修回日期：２００８．１２．１９。
万方数据
王立新等：黄粉虫不同生长阶段诱导抗菌肽的效果分析
一道防线”Ｊ。近年来，对昆虫抗菌物质的研究，特别是对昆虫抗菌肽的研究己成为一个迅速发展的新领域，越来越引起人们的关注和重视。黄粉虫在中国分布广，资源丰富，容易养殖，成本低，在医药开发方面是一个很好的资源。目前中国对果蝇、麻蝇等昆虫抗菌肽的研究文献报道较多［４１，对黄粉虫抗菌肽的研究则少有报道。
１试验材料与方法
１．１试验材料
１．１．１试验动物黄粉虫（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ）由安徽科技学院动物科学实验室饲养提供。
１．１．２试验菌种大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｆｂ安徽科技学动物医学实验室提供。
１．１－３仪器与药品仪器：垂直电泳槽、ＥＣＰ一３０００三恒电泳仪（北京市六一仪器厂）；数显恒温水浴锅（国华电器公司）；微量可调加样器（北京青云航空仪表有限公司）；高速低温离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；ＴＨＺ．Ｃ恒温振荡器（太仓市光明实验分析仪器厂）；ｓｚ．９３自动双重纯水蒸馏器（上海振荣科学仪器有限公司）；ＳＧ２．Ｔ型ｐＨ计（意大利梅特勒．托利多仪器上海有限公司１。
药品：Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＳＤＳ、Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、Ｂｉｓ．ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ｓｉｇｍａ），考马斯亮蓝Ｒ２５０，甲醇，冰醋酸等。１．２试验方法
１．２．１培养基的制作分别称取ｌＯｇ蛋白胨，５ｇ牛肉膏，５ｇ氯化钠，ｌｇ磷酸氢二钾，２０ｇ琼脂于１０００ｍｌ蒸馏水中，于水浴锅内加热搅拌使其溶解，调ｐＨ为７．４￣７．６。然后在０．１５ＭＰａ，１２６℃下灭菌３０ｍｉｎ。冷却后放到无菌操作台中将其分装在试管和培养皿内（培养皿中培养基的厚度要在５ｍｍ以上）备用。
１．２．２细菌的扩增培养将大肠杆菌接种到制好的培养基中，然后放在３７℃的恒温箱中做增菌培养。
１．２．３抗茵肽的诱导在无菌操作台中，将培养好的大肠杆菌用生理盐水稀释成一定浓度（Ｏ．５麦氏单位）的大肠杆菌液。取一定数量不同虫态（五龄幼虫、蛹、成虫）的黄粉虫，将沾有大肠杆菌液的５号针头斜刺入黄粉虫的腹部，然后将其放回新鲜配制的麸皮饲料中饲养。７２ｈ后收集存活的黄粉幼虫、蛹和成虫，以健康未处理试虫为对照。冰箱保存备用。
１．２．４抗菌肽的提取取幼虫期黄粉虫１０ｇ置于高速组织捣碎机中按藿量／体积比为１：３加入提取液（ｏ．０５ｍｏｌ／Ｌ
乙酸铵缓冲液ｐＨ
５，３５
Ｉ．ｔｇ／ｍｌ苯甲基磺酰氟ＰＭＳＦ，
２‰巯基乙醇，Ｏ．２ｍｇｍＥＤＴＡ，苯基硫脲），充分捣碎，
万方数据
匀浆液在４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ高速冷冻离心３０ｍｉｎ，取上清液，随后放至１００℃的恒温水浴箱中水浴１０ｍｉｎ，然后以１２０００ｒ／ｍｉｎ（４℃）离心３０ｍｉｎ，去除变性蛋白，用灭菌好的注射器抽取不含油层的上清液装于小试管中放入冰箱中冷藏备用。用同样的方法将蛹期和成虫期黄粉虫的抗菌物质提出。
１．２．５抗菌物质的活性检测——药敏试验
（１）原理将含有抗菌液的纸片贴在已经接种菌种的培养基平板上，纸片中所含有的抗菌物质不断向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映抗菌物质对该菌种的最小抑菌浓度
（ｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ），并与该菌种
对抗菌物质的敏感程度呈负相关，即抑菌圈愈大，ＭＩＣ愈小。
（２）步骤试验采用纸片扩散法测定抑菌圈大小，将定性滤纸用剪刀制成直径为６ｍｌｌｌ的圆形纸片，剪下的纸片消毒后放入提取的抗菌液中浸泡２～５ｍｉｎ，即成药敏纸片，每份样品提取液中至少放入五片纸片。
用固体普通培养基培养大肠杆菌，取适量菌体溶于灭菌的生理盐水中，校正浓度为０．５个麦氏标准的菌液。在无菌操作台内，将菌液均匀的涂抹于培养基表面，将接种过菌液的培养皿在无菌操作台中静置
２～５
ｍｉｎ，用无菌镊子取已浸泡好的３种含抗菌液的纸
片分别贴于同一个培养基表面，各纸片中心距离应大于２４ｌｉｍａ，纸片距培养皿内缘应大于１５ｍｉｌｌ，置３７℃培养２４ｈ后，用游标卡尺测量抑新圈的大小，记录至少五组数据。
１．２．６抗菌物质组分的检测——ｓＤｓ．聚丙烯酰胺凝胶
电泳试验
按邹毅｛”的方法进行电泳试验。
表１大肠杆菌诱导黄粉虫产生抗菌肽的抗菌活性
黄粉虫４ｉ同生长阶段
抑鼎阁阿栉／ｈｍ
幼虫期１２．５８４－０．１６
蛹期１２．１９±０．５５成虫期
１２，２６．±０．５６
２结果与分析
２．１抗菌物质的活性检测的结果与分析
从表ｌ可以看出不同生长阶段的黄粉虫经大肠杆菌诱导后，处于蛹期和成虫期的黄粉虫所产生抗菌肽的抑菌效果不如处于幼虫期的黄粉虫所产生的抗荫肽的抑菌效果。不同生产时期黄粉虫所提取抗菌肽的抗菌效果相比较差异不显著。
・１２・
审围震掌｛差攫ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
２．２抗茵物质组分检测的结果与分析
２．２．１电泳试验的分析采用带菌针刺法诱导黄粉虫不同生长阶段产生抗菌肽，在提取方法，上样量完全相同的情况下，将提取的抗菌肽进行ＳＤＳ．聚丙烯酰胺凝胶电泳试验，经染色，脱色后的分离胶上分别呈现一条清晰的区带见图１，同时可见每个区带上（除去标准蛋白所分离的区带）所含有的条带数目略有差异，但是处于不同时期的黄粉虫所提取的抗菌肽都有未被彻底分离的更小的肽段。
２．２．２电泳试验分子量的测定结果
（１）标准蛋白质的相对迁移率见表２
圈ｌ黄粉虫不同生长阶段提取抗菌肽的电泳分析
注，０所指的带为标准蛋白被分离的区带：ｌ所指带的是黄粉虫成虫期所提取的抗苗肽被分离的区带：２所指的是黄粉虫蛹期所提取的抗菌肽被分离的区带；３所指的是黄粉虫幼虫期所提取的抗菌肽被分离的区带。
表２标准蛋白质ＳＤＳ一聚丙烯酰胺的相对迁移率
分了量／Ｄａ
槲对迁移牢品
２０１０００．１４１４４０００．２５７６０００．４１６２００
０．４５３４００
Ｏ．５２
迁移率（碍）＝蛋白质的迁移距离／示踪染料的迁移距离（蛋白质的迁移距离是指从分离胶的起始位到蛋自质条带的前缘；示踪染料的迁移距离是指从分离胶的起始位到溴酚兰指示剂的前缘）。
以已知蛋白质分子量为纵坐标，辟为横坐标绘图，位于凝胶中间的区域便可以得到一条近似直线，见图
２。
万方数据
跖∞０蛊加∞Ｄ
咖ｌｍ求坫∞０
蟋
皿ｍ
∞Ｏ
嘟
掣蜷
０∞Ｏ
Ｏ
Ｏ
０．４
０．６
标准蛋白的相对迁移率
图２标准蛋白相对迁移率与蛋白质分子量的曲线图
（２）未知蛋白质的相对迁移率的计算
通过迁移率（琦）＝蛋白质的迁移距离／示踪染料的迁移距离的公式，计算出未知蛋白质的Ｒｆ值，见表３。
通过测定未知的蛋白质的Ｒｆ值，便可在标准曲线上读出它的分子量，由图１可知黄粉虫幼虫期有八条带，其相对的近似分子量分别为２５
０００、１６５００、
１５５００、１３０００、１２５００、１００００、８７００、５３００
Ｄａ；黄粉虫
蛹期有五条带，其相对近似的分子量分别为２５
０００、
２１５００、１６５００、１２５００、５８００
Ｄａ；黄粉虫成虫期期有五
条带，其相对近似的分子量分别为２５
０００、２１５００、
】６５００、１２５００、６２００Ｄａ。
表３不同生长阶段黄粉虫蛋白质的相对迁移率
注：表示抗菌肽还有更小的肽段未被分离开，这是由于分离胶梯
度不明湿所致。
３讨论
３．１黄粉虫抗茵肽的抗菌效果
昆虫抗菌肽对许多致病菌（包括高度耐药性细菌菌株，如致病型大肠杆菌、硝酸盐杆菌、伤寒杆菌、金葡萄球菌等）均有抗菌作用［６】。国内外已对抗菌肽杀伤肿瘤细胞的作用进行广泛研究，并取得可喜成果。天蚕素是最早发现的抗菌肽，它对革兰氏阳性菌和阴性菌
王立新等：黄粉虫不同生长阶段诱导抗菌肽的效果分析
・
１３・
都有较高的抗菌性用。此次试验结果显示，不同生长阶段黄粉虫所提取的抗菌肽均对大肠杆菌有一定的抗菌效果，但是抗菌效果并不理想。这有可能是由于黄粉虫抗菌肽在提取过程中并没有彻底提纯所致。至于所提取的抗菌肽对其它细菌及肿瘤细胞有无抑制和杀伤作用有待进一步研究。３．２电泳试验
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）具有蛋向质的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应，具有很高的分辨率，且不易扩散，是鉴定蛋白质的有力工具嗍。但它对于相对分子质量小于１００００的蛋白质来说，是无能为力的唧。大多数的昆虫抗菌肽相对分子质量均小于１００００，它们是一些生物活性小分子肽，具有热较稳定性、水溶性好、强碱性和广谱抗菌等特点Ｏｏ－ｕ！。邹毅等改进了ＰＡＧＥ，用一种新的实验系统Ｔｈｅｍｅ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥ来分离小分子蛋白，即用ＴｈｅｍｅｆＮ一三甲基甘氨酸）代替以往使用的Ｇｌｙｃｉｎｅ（甘氨酸），从而使较小的蛋白质分子被压成较窄的电泳条带。笔者正是采用这种方法来分离不同生长阶段黄粉虫抗菌肽的。
黄粉虫的生活史需要经历四个虫态，即卵、幼虫、蛹和成虫。笔者对其除卵以外的三个虫态的抗菌物质进行了提取并做了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在已做的三个虫态中，蛹是相对静止的虫态，在这期间不摄取物质，与外界环境关系不是很大，而幼虫和成虫是营养和生殖阶段，它们的新陈代谢以及生长发育都受到周围环境的直接影响。在黄粉虫的生长过程中，如果外界环境良好，处于幼虫期和蛹期的黄粉虫很少出现死亡，处于成虫期的黄粉虫死亡率虽高于其它生长时期但是没有大面积的产生流行病，这不能不认为是其体内的抗菌物质起了重要作用。从笔者对这三个虫态的黄粉虫抗菌肽的电泳分析中可以看到，黄粉虫幼虫期抗菌肽与蛹和成虫期相比不仅条带多，而且存在相对分子质量较小的肽段。
已有一些学者对家蝇幼虫的抗菌肽成分进行了研究，丘晓燕等ｕ２１提取出了２种抗菌肽，相对分子质量分别在４０００和９４００。王继恒等ｍ】报道有５种，张庆华等”帕
万方数据
报道家蝇幼虫有七条带，蛹有四条带，成虫有五条带，其它昆虫不同虫态的抗菌肽研究还未见报道。试验分离到黄粉虫幼虫有８条带，蛹和成虫有５条带，分子量大（２５０００
Ｄａ）的是一些蛋白质，小于１０
０００
Ｄａ的是
多肽，从电泳结果看，在幼虫期小于１０
０００
Ｄａ的肽段
较多。
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