普通光学显微镜的使用及细菌的革兰氏染色法
生命科学学院09级生命基地 林剑锋（[1**********]5）
摘要
本次试验的主要目的是通过用油镜观察经过复染色的细菌玻片，分辨细菌的革兰氏阴阳性。通过实验学习光学显微镜油镜的使用原理与方法、细菌的革兰氏染色法及分类鉴定的原理。 Abstract
We aim at distinguishing Gram-positive and Gram-negative bacteria by making use of oil immersion lens to observe the stained microscope slides. We can learn the principles of Oil
immersion objective as well as the way to use it and learn about Gram staining and classification and determination via this experiment.
关键词 油镜 革兰氏染色 Key words Oil immersion objective Gram staining
在微生物中，如果所有的都一视同仁的做实验的话，那么我们要区分某些性质不同的微生物的时候，就会很麻烦，增加相当大的工作量。但是，革兰氏染色却可以把微生物分为两大类，革兰氏阳性和革兰氏阴性，让我们能够在显微镜下轻易分辨出来，从而大大减小了工作量与工作难度。比如说，有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。
1．基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色。因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高。当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色。然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(mordant)；脱色剂(decolorizing agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。碘(iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。
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即革兰阳性菌和革兰阴性菌,可用于鉴别细菌；研究细菌的致病性，革兰阳性菌可产生外毒素，革兰阴性菌可产生内毒素；选择敏感的抗生素，革兰阳性菌可使用青霉素等作用于细胞壁的抗生素，革兰阴性菌可使用红霉素、链霉素等抑制蛋白质合成的抗生素。
2．实验材料与方法
2.1实验材料
光学显微镜，载玻片若干，酒精灯，接种环，香柏油(cedar oil)，碘液，结晶紫，番红，酒精，二甲苯，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，大肠杆菌（学名：Escherichia coli，通常简写为E. coli）)
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2.2.1 制片
取活跃生长期的菌种，按常规方法涂片（不易过厚）。注意标记好各菌种代表哪种菌。然后再酒精灯上细微烘烤干燥，固定。 2.2.2革兰氏染色
2.2.2.1初染（Primary Stain）
滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1~2min后倾去染液，水洗至流出水无色。冲洗时，注意水流不宜过大，且用水冲载玻片的反面。
2.2.2.2媒染（Mordanting）
先用卢戈氏碘液冲去残留的水迹，再用碘液覆盖菌种1min。倾去碘液，水洗至流出水无色。
2.2.2.3脱色（Decolorzation）
将玻片上的残留水用吸水纸吸取，在白色背景下用滴管加95%乙醇脱色20~30s，当流出液无色时，立即用水洗去乙醇。注意，应该严格控制乙醇脱色的时间，应避免事件过长或过短，因为那样都会影响最后的实验结果。
2.2.2.4复染（Counter Stain）
将玻片上残留的水用吸水纸吸取，用番红染液复染2min，水洗，吸取残水后在酒精灯上微微烤干。 2.2.3 镜验
2.2.3.1低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置。
2.2.3.2从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏
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镜头）。
2.2.3.3从接目镜内观察,进一步调节光线。使光线明亮,再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止。然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。
2.2.3.4观察记录现象结果。
2.2.3.5观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
3．实验结果与分析
图1 枯草芽孢杆菌 图2 金黄色葡萄球菌
图3 大肠杆菌
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3.2实验分析
枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色。因此，呈现蓝紫色；大肠杆菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高。当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色。然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。 参考书目
沈萍，陈向东.微生物学.第二版.北京:高等教育出版社，2006
沈萍，陈向东.微生物学实验.第4版.北京:高等教育出版社，2007
Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins ISBN 0-13-066271-2.
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