浅谈毛细管电泳的基本原理及相关技术

宁夏农林科技,NingxiaJournalofAgri.andFores.Sci.&Tech.2012,53(11):91-92,9591

浅谈毛细管电泳的基本原理及相关技术

徐祥云,彭君,何志坤

曲靖医学高等专科学校,云南曲靖

655000

要:毛细管电泳是新型液相分离分析技术,具有高效、快速、灵敏、试剂和样品用量少等特点。在介绍毛细管电泳分析分

离基本原理的基础上,阐述了毛细管电泳的分离形式及应用范围,包括毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管胶束电动毛细管等电聚焦及毛细管等速电泳形式及应用范围等,并探讨了毛细管电泳的几种检测方法,包括紫外检测器检测、激色、

CE-MS联用检测及电化学检测器检测等。光诱导荧光检测、

关键词:毛细管电泳;基本原理;技术中图分类号:R914.1

文献标识码:A

文章编号:1002-204X(2012)11-0091-02

BasicPrincipleofCapillaryElectrophoresisandRelatedTechnology

)XUXiang-yunetal.(QujingMedicalScienceSeniorCollege,Qujing,Yunnan655000

AbstractCapillaryelectrophoresisisanewliquidphaseseparationandanalysistechnology,whichhasthecharacteristicsofhighefficiency,fastspeed,agility,lessconsumptionofreagentandsample.Basedonintroductionofthebasicprincipleofcapillaryelectrophoresisanalysisandseparation,thepaperelaboratestheseparationformandapplicationscopeofcapillaryelectrophoresis,includingformandapplicationscopeofcapillaryzoneelectrophoresis,capillarygelelectrophoresis,micellarelectrokineticcapillarychromatography,capillaryisoelectricfocusingandcapillaryisotachophoresis.Thepaperalsoexploresseveraldetectionmethodsofcapillaryelectrophoresis,includingultravioletdetectordetection,laserinducedfluorescencedetection,CE-MSdetectionandelectrochemicaldetectordetection.KeywordsCapillaryelectrophoresis;Basicprinciple;Technology

毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis,CE)又称高效毛细管电泳或毛细管电分离法,是一类以毛细管为载体、以高压直流电场为动力,依据样品中各组分迁移速度和分配行快为的差异而实现分离的新型液相分离技术,具有高效、速、灵敏、试剂和样品用量少等特点,是近年来发展最快的分析方法之一。近年来,CE用以分析多肽、蛋白质、核苷酸乃至脱氧核糖核酸等物质,并且达到了以生物工程为代表的生命科学各领域中对该类物质的分离分析要求,因此得到了广泛的应用和迅速的应用和发展。笔者对毛细管电泳技术的基本原理进行阐述,并从毛细管电泳检测方法及毛细管电泳的分离模式等方面对毛细管电泳技术进行论述,旨在为相关研究提供参考。

成电渗液。然后带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳速度和电渗流二者的矢量之和。假如毛细管两端加的是带正向电压,则正电荷粒子最先流出,中性粒子的电泳速度相当于电渗流速度;带负电荷粒子运动方向与EOF方向相反,但EOF速度一般大于电泳速度,故其最终会在中性粒子之后流出,从而实现各种粒子的分离。

2毛细管电泳的分离形式及应用范围

2.1毛细管区带电泳(CZE)

CZE是使用裸毛细管和真溶液性质的电解质缓冲溶液进行的毛细管电泳技术,是毛细管电泳中应用最广泛、最基本的一种分离模式。CZE分离机理是基于各被分离组分的荷质比之间的差异。在电场力作用下,分离物质在背景缓冲溶液中因迁移速度的差异而分离,除了溶质组分的结构特点和背景缓冲溶液组成外,不通过其他因素(如聚合物网pH梯度或其他分配相等)对分离条件的影响。通常把络、

CZE看成其他各种毛细管电泳分离模式的母体。应用范围多肽、蛋白质、离子、对映体拆分和很多其他本包括氨基酸、

身能带电或在一定条件下能带上电荷物质的分离。2.2毛细管凝胶电泳(CGE)

CGE是以凝胶或高浓度线性高分子溶液为介质填充

1毛细管电泳基本原理

毛细管电泳是以高压电场为源动力,以毛细管为载体,依据样品中各组分之间迁移速度的差异和分配行为的不同而实现分离的一类液相分离分析技术。分析分离装置主要包括高压电源及其回路系统、毛细管柱系统、检测器系统(可为柱上检测或者与其他检测技术联用)和进样系统。在电解质缓冲溶液中,通过一定的方法带上电荷样品粒子在高压电场作用下,以不同的速度随电渗流迁移,先后到达检测器被检测。CE所用的石英毛细管柱在内充液pH>3时,其表面硅羟基解离成-SiO2-,使内壁带上负电荷,和溶液作用形成双电层。在高电压电场作用下,双电层中溶剂化的水合阳离子层引起柱中溶液在毛细管内整体向负极移动,形

作者简介:徐祥云(1978-),男,彝族,云南曲靖人,讲师,从事分析化学研究。

收稿日期:2012-05-25

92

徐祥云,等浅谈毛细管电泳的基本原理及相关技术53卷11期

在毛细管内而进行的电泳。被分析组分因电泳而迁移,在迁移过程中依据分子的大小在起“分子筛”作用的凝胶中得以分离。该方法常用于生物大分子的分离,如蛋白质、核糖核寡聚核苷酸、DNA片段分离、DNA测序及聚合酶链反应酸、

产物分析。CGE能达到CE中最高的柱效,是解决人类基因组计划的核心技术。

2.3毛细管胶束电动色(MEKC)

MEKC采用临界胶束浓度以上的表面活性剂在运行缓冲液内形成疏水内核、外部带负电的动态胶束假固相,利用溶质的疏水性差异,在溶液和胶束假固相间分配的差异进行分离。该方法不仅能分离中性溶质,而且能分离带电组分,拓展了毛细管电泳技术的应用范围。毛细管电泳技中性物质、手性对映体及药物等的术现广泛用于小分子、分析分离。

2.4毛细管等电聚焦(CIEF)

CIEF是指依据两性化合物等电点的差别,当施加直流电压时,在毛细管内将建立起由阳极到阴极逐步升高的pH梯度,具有不同等电点的物质在电场作用下迁移到等电点的pH位置,聚集形成窄的聚焦区带,使各种组分达到分离。CIEF已成功用于测定蛋白质的等电点,分离异构体等。如分别用CZE和CIEF研究制备过程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,结果表明,CIEF方法要比CZE的效果好。2.5毛细管等速电泳(CITF)

CITF是一种“移动界面”电泳技术,采用2种淌度差别很大的缓冲液分别作为先导电解质(充满毛细管)和尾随电解质(置于一端的电解槽中),使被分离物质按其电泳淌度不同,在先导离子和尾随离子之间形成区带,从而得以分离。该方法目前常用作柱前浓缩方法用以富集样品,以提高毛细管电泳的灵敏度,降低检出限,可用于紫外吸收弱的样品组分的分离。

2.6毛细管电色谱(CEC)模式

CEC是将高效液相色谱的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。该模式兼具电泳和液相色谱的分离机制。它具有毛细管电泳与液相色谱的优点。

被分析物的选择性,但因被测物须用荧光试剂标记,所以染色弱不显荧光时则需染色后方能检测。LIF技术可以检出染色的单个DNA分子,该方法可用于向癌症的早期诊断及LIF向临床酶和免疫学检测。从现有的应用及LIF的特点,以下3个方向发展:①在原有He—Cr激光器和Ar离子激光器之外,向着更加便宜、检测波长范围较长的二极管激光器;②为增加LIF的使用范围,将发展更多的荧光标记试剂;③开展更多的关于应用方面的研究。LIF和微透析技术联用可测定脑中神经肽。采用波长分辨荧光检测器可提供关于蛋白和DNA序列的一些结构以及动态信息。另外,一些适用于二极管激光器的荧光标记试剂(如CY-5等)正在不断被开发和应用。3.3CE-MS联用检测

将CE和能提供组分结构信息的MS联用,发挥了CE灵敏度高及选择性强的优点,弥补了CE在定性鉴定方面的缺点。CE-MS联用主要向2方面发展:①不同CE模式和MS联用;②CE和不同MS技术联用。该联用技术的核心是解决接口装置问题。现已成功地应用到CE-MS接口中的有离子化技术,有大气压化学电离、电喷雾、离子喷雾、基体辅助激光解吸离子化、连续流快原子轰击、等离子体解析、音波喷雾离子化等。且6种CE模式均已和MS联用。最早报道CE-MS联用技术是采用单级四极杆质谱,现已发展到三时间飞行质谱、离子阱质谱、磁质谱、电感锅级四极杆质谱、

台等离子体质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。CE-MS联用特别适用于复杂生物体系的分离鉴定。因CE-MS所需样品少,目前大部分运用集中在基因工程产品和蛋白样品,如CIEF-ESI-MS用于监测蛋白的去折迭过程以及对基因工程药物促红细胞生成素的综合评价等。用CE-ICP-MS进行元素分析、成功地用CE-FTICR-MS分离和鉴定单个红细胞中血红蛋白的α和β链等,以及对联接CE-TOF-MS的新激光蒸发离子化接口的研究都表明,CE-MS联用已成为CE研究中的热点,CE-MS联用在中药复杂体系分离分析中将起更为重要的作用。3.4电化学检测器(EC)检测

由于可避免光学类检测器遇到的光程太短的不足,EC和LIF同为CE中灵敏度最高的检测方法。目前报道最多的是CE-安培检测器,在研究中常用碳纤维微电极测定单细胞极微量神经递质(如多巴胺等)。也可用脉冲伏安法或循环伏安法进行糖、糖肽以及金属离子的测定,另一类常用的EC是电导检测器,该检测器对Li+的检测限达10-15mol。

3.5化学发光检测器(CL)检测

CL是一种外接检测器,具有结构简单、灵敏度高等特点,近年来因应用范围广泛且灵敏度高而被高度重视。用CL检测血红蛋白,其检测限比UV降低约4个数量级。应用最多的仍是鲁米那体系,因该体系对多数待测物例如某

(下转第95页)

3毛细管电泳检测方法

3.1紫外检测器(UV)检测

UV检测是一种柱上在线检测技术,其集中在提高灵敏度,常采用平面积分检测池。该设计可使检测光路增加其线性范围和到1cm。也有用光散射二极管作为光源,

信噪比都优于汞灯。UV检测简单,方便,但该方法总体来说进展不大。

3.2激光诱导荧光检测(LIF)

LIF也是柱上在线分析分离检测技术,是CE灵敏度较高检测器的一种,因而极大地扩大了CE的应用范围,如DNA测序就须用LIF,单分子和单细胞的检测利用LIF进同时显著提高了行检测。LIF提高了毛细管电泳的灵敏度,

53卷11期潘兴桥,等超高压技术提取太子参多糖的工艺研究95

表2

试验号123456789K1K2K3R

A11122233328.73329.16735.2336.500

4

L(正交试验结果93)

3结论

多糖提取率

因素B12312312331.23330.46731.4330.966

C12323131230.36730.86731.9001.533

D12331223131.10032.06729.9672.100

通过采用超高压技术提取太子参的多糖,对影响提取率的温度、料液比、压力及保压时间进行单因素试验,最后结合正交优化设计方法得出:超高压技术提取太子参多糖最佳工艺参数为温度55℃,保压时间6min,料液比1︰60(g/mL),提取压力350MPa,该条件下太子参多糖的平均提取率为37.56%。参考文献:

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)(%28.329.028.928.129.529.937.332.935.5

温度55℃,保压时间6min,提取压力350MPa,料液比1︰60(g/mL)。2.3工艺验证试验

精密称取太子参粉末1.0000g,按上述最佳提取工艺按“1.3.1”项方法测定提取条件提取,进行3次平行试验,率。结果表明:多糖提取率分别为37.50%、37.34%、37.84%,平均提取率为37.56%,RSD=0.6798%(n=3),说明该提取工艺合理、稳定、可行。(上接第92页)

些金属离子、氨基酸及其衍生物的检测灵敏度较高,且反应在水相中进行,提高了其应用范围及灵敏度。如Co(Ⅱ)的检测限可达20zmol,用间接CL法可测定100~400fmol未标记的氨基酸,线性范围达2个数量级。电致化学发光)也已成功地用作CE检测。鲁米那等发光标记物在蛋(ECL

白及基因的CE-CL检测中可能有很大的发展潜力,其应用范围也将会得到进一步扩大。3.6其他检测器检测

采用激光作激发源的除LIF外,还有激光光热检测、激光热透镜检测和激光拉曼检测等检测器。普通荧光检测器研究集中在开发新的荧光标记物,以提高检测灵敏度。同位但测素检测器具有高灵敏度和高选择性,可达10mol/L,

-9

责任编辑:李晓瑞

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定时需经同位素标记,所以应用范围受到了限制。

4展望

毛细管电泳技术是20世纪80年代发展起来的新型物理分析分离技术,具有高效、稳定、高灵敏的优点,可以对超微量样品进行定性定量分析。在天然产物化学分析、药品含量检测、食品工业监测等研究方面有着广泛的应用前景,在广大的分析分离领域中都具有巨大的发展潜力。将CE与各种检测技术联用,其检测高灵敏度的发展,分析分离的灵敏度会得到提高,易应用于自动化操作,有望成为分析分离领域的重要分析手段。

责任编辑:张杨林


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