中国水稻科学（ＣｈｉｎｅｓｅＪＲｉｃｅＳｃｉ）．２００８．２２（６）：５７１～５７７ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｉｃｅｓｃｉ．ｃａ
５７１
水稻小粒矮突变性状与Ｔ－ＤＮＡ插入标签的共分离检测
马玉银１，３潘学彪１，＊
（－扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室／植物功能基因组学教育部重点实验室，江苏扬州２２５００９；２华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉４３００７０；３扬州教育学院生物化学系，江苏扬州２２５００２；‘通讯联系人，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈｕｉｄａｏ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
张亚芳１潘存红１李爱宏１
吴旭江１左示敏１陈宗祥１吴昌银２
Ｃｏ－ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＢｅｔｗｅｅｎＴ—ＤＮＡＴａｇａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＳｍａｌｌＧｒａｉｎＤｗａｒｆＭｕｔａｎｔｉｎＲｉｃｅ
ＭＡＹｕ－ｙｉｎｌｗ，ＺＨＡＮＧＹａ－ｆａｎ９１，ＰＡＮＣｕｎ－ｈｏｎ９１，ＬｌＡｉ－ｈｏｎ９１，ＷｕＸｕ－ｊｉａｎ９１，ＺｕｏＳｈｉ—ｒａｉｎｌ，ＣＨＥＮＺｏｎｇ－ｘｉａｎ９１，ＷｕＣｈａｎｇ－ｙｉｎ２．ＰＡＮＸｕｅ－ｂｉａｏＩ・。
（１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
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。Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｕｉｄａｏ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｓｍａｌｌＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｉｓｃｏｐｉｅｓ
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摘要：从Ｔ－ＤＮＡ水稻标签系中发现１个标签系中出现了小粒矮（ｓｇｄ）突变性状的分离。为克隆该突变基因和进行基因功能研究．对该突变体进行了遗传分析。该标签系存在多个插入事件，且Ｔ３代发现目标突变性状分离系中．另一个非目标插入事件已经纯合，故特异ＰＣＲ检测不能确认小粒矮突变性状与Ｔ—ＤＮＡ插入共分离。但通过ＴＡＩＬ＿ＰＣＲ方法，获得了插入点侧翼的水稻基因组序列，并证实该侧翼序列与小粒矮突变性状共分离。
关键词：Ｔ－ＤＮＡ标签技术；侧翼序列；共分离；水稻；小粒矮突变中图分类号：Ｑ９４３．２Ｉ￥５１１．０３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００１—７２１６（２００８）０６－０５７１—０７
水稻突变体是研究水稻功能基因组学的基础材料［１ｌ。产生水稻突变体的方法主要有理化诱变、Ｔ－ＤＮＡ插入、转座子插入和逆转座子插入等［２］，其中利用Ｔ—ＤＮＡ随机插入水稻基因组来产生突变体，并以Ｔ—ＤＮＡ为标签分离突变基因的方法得到了广泛应用。目前，国内外已经有多个研究小组构建了水稻Ｔ—ＤＮＡ插入突变体库［３—４］，据不完全统计，获得的突变体总数有１５万份左右。已有报道用Ｔ—ＤＮＡ标签方法克隆了ＯｓＣＨＬＨ［５｜、ＯｓＣＰｌ［６｜、Ｏｓ－ＭＡＤ￥５０［７］、ＯｓＧＣＳＩｓ］、ＯｓＧＮＡＩ［９］、ｕｄｔｌ［１０３、ＦＯＮｌ［１１３、ＯｓＬＧｌ［１２３和ＤＨｌ［１３］等一批水稻功能基因。本文报道一个由于Ｔ—ＤＮＡ插入所引起的小粒矮突变体（ｓｇｄ突变体），并对该突变体进行了遗传分析，为克隆该基因和进一步的基因功能研究奠定了基础。
１材料与方法
１．１水稻材料
本实验室于２００３年从华中农业大学引进通过农杆菌转化法构建的水稻突变体库，完成了４４１６份Ｔ—ＤＮＡ水稻标签系的表型鉴定。本研究所用材料为小粒矮突变系。
１．２方法
１．２．１
目标性状植株的ＤＮＡ提取
对各标签系的后代株系逐株进行目标突变性状
收稿日期：２００８—０７一０１；修改稿收到日期：２００８—０９—１７。
基金项目：国家重大科技专项资助项目；。长三角两省一市联合科技攻关”资助项目（ＢＥ２００４３９９）。
第一作者简介：马玉银（１９６３－－），男，副教授，博士研究生。
中国水稻科学（ＣｈｉｎｅｓｅＪＲｉｃｅＳｃｉ）第２２卷第６期（２００８年１１月）
调查，并逐株取样，植株总ＤＮＡ的提取参照Ｄｅｌｌａ—ｐｏｒｔａ等［１４］的ＣＴＡＢ法进行，略加改动。
１．２。２
模板ＤＮＡ浓度一般约为１５～２０ｎｇ。根据转化载体的序列设计特异巢式引物（表２）：ＴＡＩＬ—ＰＣＲ的一、二、三级反应体系同１．２．３，ＴＡＩＬ—ＰＣＲ的一级产物稀释２０倍作为二级反应的ＤＮＡ模板，同样，ＴＡＩＬ—ＰＣＲ的二级产物稀释２０倍作为三级反应的ＤＮＡ模板。将左边界、右边界特异引物分别与随机引物进行配对，获得ＴＡＩＬ－ＰＣＲ的一、二、三级产物，一、二、三级产物加在相邻的泳道中进行电泳。
获得的ＴＡＩＩ。一ＰＣＲ三级产物以５“Ｌ反应体系的核酸酶和磷酸化酶进行纯化处理（３７℃下６０ｍｉｎ；８０℃下灭活酶活性２０ｒａｉｎ），然后直接测序。１．２．５侧翼序列共分离检测
侧翼序列经过与公共数据库的比对，找到Ｔ—在基因组序列和相比邻的Ｔ—ＤＮＡ序列上设计ｌ对因组序列上设计另ｌ对引物（Ｇ１、Ｇ２引物）。Ｇ１引物序列为：５，－ＡＴＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＴＡＴＧＣＴＣＧ－３’；Ｇ２引物序列：５『＿ＴＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＴＣＴＴ一３’，Ｔ引物序列：５＇－ＣＣＡＧＴＡＣＴＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴ－３’。用这两对引物分别进行ＰＣＲ检测，判断侧翼序列是否与突变性状共分离。
Ｔ—ＤＮＡ标签引物设计
根据插入的Ｔ—ＤＮＡ序列设计引物对（基于ＧＡＬ４／ＵＡＳ编码区段序列），正向引物：５，＿ＧＧＣＡＴＣＧＧＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴ一３’，反向引物：５ｆ－ＧＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＣ－３’，其扩增片段长度为０．６１１
１．２．３
ｋｂ。
ＰＣＲ检测Ｔ—ＤＮＡ标签共分离现象
ｔｔＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ２．０
反应体系为：ＤＮＡ模板１
肛Ｌ，２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ１．０弘Ｌ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌｚ２．０ｐＬ，１０
ｍｍｏｌ／Ｌ正反向引物各０．２肛Ｌ，Ｔａｑ酶
０．２肛Ｌ，加ｄｄＨ２０至２０ｐＬ。反应程序为：９４℃下
４ｍｉｎ；９４℃下１
ｒａｉｎ，５８℃下１ｍｉｎ，７２℃下１ｍｉｎ，
３５个循环；７２℃下延伸１０ｍｉｎ，４℃下保存。扩增产物在２．０％的琼脂糖凝胶上电泳。对各小区突变株和正常株的ＰＣＲ结果进行分析，初步判断突变性状是否与插入事件共分离。
１．２．４
ＴＡＩＬ—ＰＣＲ获取Ｔ—ＤＮＡ插入点侧翼序列
对初步检测为共分离的标签系，采用ＴＡＩＬ＿ＰＣＲ方法（Ｔｈｅｒｍａｌ
ＡｓｙｍｍｅｔｒｉｃＩｎｔｅｒｌａｃｅｄＰＣＲ，
热循环不对称ＰＣＲ法［４］），获得Ｔ－ＤＮＡ插入点侧翼的基因组序列的扩增产物。分离第３级电泳获得的侧翼序列条带，在扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室测序（ＤＮＡ测序仪３１３０，美国ＡＤＩ公司生产）。
ＴＡＩｌ。一Ｐ．ＣＲ参照Ｌｉｕ等方法［１５＿１６］（表１）。
２结果与分析
２．１小粒矮突变体的表型
在４４１６份Ｔ—ＤＮＡ标签系群体中，我们发现有１个标签系中（２０株）产生了小粒矮突变性状的
表１ＴＡＩＬ－ＰＣＲ反应程序
Ｔａｂｌｅ１．ＴＡｌＬ－ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．
马玉银等：水稻小粒矮突变性状与Ｔ—ＤＮＡ插入标签的共分离检测
５７３
襄２特异巢式引物序列
ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ
Ｔａｂｌｅ２．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
ｎａｍｅ
ｂｏｕｎｄｏｆＴ—ＤＮＡ
引物序列（５’－－＊＇３７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５’・３
７）
左边界特异引物Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ＬＢＴｌＬＢＴ２ＬＢＴ３
ｐｒｉｍｅｒ
ｏｆｌｅｆｔ
ＣＴＣＧＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＧＴＡＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴ
ｐｒｉｍｅｒ
右边界特异引物Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ＰＦＲＢｌＰＦＲＢ２ＰＦＲＢ３
ｏｆｒｉｇｈｔｂｏｕｎｄｏｆＴ—ＤＮＡ
ＧＡＧＡＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＴＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧ
ＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＡＧＡＡ
●
随机引物Ｒａｎｄｏｍ
ＡＤｌＡＤ２ＡＤ２ａ
ｐｒｉｍｅｒ
ＴＧＷＧＮＡＧＳＡＮＣＡＳＡＧＡＡＧＷＧＮＡＧＷＡＮＣＡＷＡＧＧ
（ＡＧＣＴ）ＧＴＣＧＡ（ＧＣ）（ＡＴ）ＧＡ（ＡＧＣＴ）Ａ（ＡＴ）ＧＡＡ
ＡＤ２—１
ＡＤ３ＡＤ４ＡＤ５ＧＡＤ７ＡＤ８
ＮＧＡＣＧＡＳＷＧＡＮＡＷＧＡＡ
ＳＴＴＧＮＴＡＳＴＮＣＴＮＴＧＣ
ＷＧＴＧＮＡＧＷＡＮＣＡＮＡＧＡ
（ＡＧＣＴ）ＴＣＧＡ（ＧＣ）Ｔ（ＡＴ）Ｔ（ＧＣ）Ｇ（ＡＴ）ＧＴＴＴＧ（ＡＴ）ＧＮＡＧ（ＡＴ）ＡＮＣＡ（ＧＣ）ＡＧＡ
ＡＧ（ＡＴ）Ｇ（ＡＧＣＴ）ＡＧ（ＡＴ）Ａ（ＡＧＣＴ）ＣＡ（ＡＴ）ＡＧＧ（ＡＴ）ＧＴＧ（ＡＧＴＣ）ＡＧ（ＡＴ）Ａ（ＡＧＣＴ）ＣＡ（ＡＧＣＴ）ＡＧＡ
ＴＧ（ＡＴ）ＧＮＡＧ（ＧＣ）ＡＮＣＡ（ＧＣ）ＡＧＡ
ＡＤｌＯＧ
ＡＤｌｌ
Ｗ＝Ａ或Ｔ；Ｓ＝Ｇ或ＣＩＮ—Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ中任意一种碱基。Ｗ＝ＡｏｒＴ●Ｓ＝Ｇ
ｏｒＣ；Ｎｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓａｎｙｏｎｅ
ｏｆＡ，Ｔ，Ｇ
ａｎｄＣ．
矮、籽粒变短、着粒变密和穗型直立等突变性状。将该标签系命名为小粒矮（ｓｍａｌｌ变系（图１）。
ｇｒａｉｎ
２．２小粒矮突变性状与Ｔ－ＤＮＡ插入的关系
该标签系Ｔ１代群体规模较小，仅种植了２０．个单株。其中３个单株表现出小粒矮突变。收获了其中全部突变单株，并随机收获了５株表型正常植株。
将这些植株的后代分别种植成Ｔ２小区，发现所有小粒矮植株的后代全部表现为小粒矮，说明小粒矮突变是一个可遗传的性状。所有表现目标性状分离的小区中，正常型与突变型的总比例接近３：１，初步判断小粒矮性状是由１对隐性突变基因控制的。基于插入片段的特异ＰＣＲ结果显示，所有突变体均为阳性，表明突变性状可能与插入事件有关。对植株数量最多（３５株）的１个分离小区（编号５２１７）进行ＰＣＲ检测。结果表明所有植株包括表型正常株全为阳性。由此推测，该突变系中存在２个或更多拷贝的Ｔ—ＤＮＡ插入事件，突变性状可能与其中的一个插入事件有关。从编号为５２１７的小区中继续收获了一定数量的突变株种子和表型正常株
种子。
ｄｗａｒｆ，ｓｇｄ）突
２００６年和２００７年正季（Ｔ３和Ｔ４代），继续追踪小粒矮突变性状与Ｔ—ＤＮＡ插入的关系，其检测结
图１
小粒矮（ｓｇｄ）突变体与对照中花１１植株
ｓｇｄｍｕｔａｎｔａｎｄ
ｉｔｓ
果见表３。结果表明，在所有小粒矮植株的后代小
ｐａｒｅｎｔ
Ｆｉｇ．１．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆ
１１．
ｗｉｌｄ
Ｚｈｏｎｇｈｕａ
区中未出现表型正常植株；部分表型正常株的后代小区中未出现突变植株，而另一些小区则发生性状
中国水稻科学（ＣｈｉｎｅｓｅＪＲｉｃｅＳｃｉ）第２２卷第６期（２００８年１１月）
表３基于插入片段的特异ＰＣＲ检测结果
Ｔａｂｌｅ３．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＴ３ａｎｄＴ４ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ
ｆｒｏｍＴ－ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ．
分离。Ｔ３代的分离小区中，正常型与突变型植株的总分离比为３．８７５：１（ｘ２＝１．２５６＜ｘａ．０５＝３．８４）；Ｔ４代分离小区中的正常型与突变型的总分离比为３．１６：１（Ｙ２—０．３２８＜Ｙ６．０５—３．８４），均接近３：１。这进一步说明小粒矮突变性状由１对隐性基因控制。
从ＰＣＲ检测结果来看，在各世代的所有小区中，所有植株的检测结果均为阳性。这可能是由于小粒矮突变标签系中存在两个甚至更多的非串联插入事件，而我们最初在Ｔ１代标签系中选择表型正常株的数量过少，导致Ｔ２代只有１个能够构成群体的目标性状分离小区，从中选择了较多正常株，但它们的后代群体（无论是纯合野生型群体还是目标性状分离群体）中仍没有出现阴性单株。因此，可以推断，当初Ｔ１代获得的那个杂合单株（由此衍生出Ｔ２
代分离株系５２１７）中，存在多个非串联插入事件，且其中１个与目标突变性状无关的插入事件已经纯合。这样，基于Ｔ—ＤＮＡ标签的特异ＰＣＲ只能获得所有植株均为阳性的结果。依据这个杂合株的后代群体，已经不可能判断目标突变性状与插人事件的相互关系，进一步研究的难度大大增加。
２．３
Ｔ－ＤＮＡ插入片段侧翼序列的分离
为了使研究能够继续下去，我们尝试采用
ＴＡＩＬ－ＰＣＲＥ４］方法，以获得目标插入位点侧翼的水稻基因组序列。
由左边界特异引物与随机引物ＡＤ８组合扩增，获得了１条ＴＡＩＬ—ＰＣＲ三级产物（图２）。对该三级产物进行测序，获得侧翼序列，利用ＮＣＢＩ网站上提供的ＢＬＡＳＴ程序进行水稻全基因组搜索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／），找到侧翼序列位于水稻
图２ＴＡＩＬ－ＰＣＲ扩增结果
Ｆｉｇ．２．ＴＡｌＬ，ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｓｇｄｍｕｔａｎｔ．
单数泳道为二级产物，双数泳道为三级产物。每种嵌套引物采用２次点样重复。其中．第６、８泳道为同一种嵌套引物的三级扩增产物。图中其他引物对均未扩增得到三级产物。
Ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｒｅａｃｔｉｏｎａｒｅ
ｌｉｓｔｅｄｉｎｔｈｅｏｄｄｌａｎｅｓｗｈｉｌｅ
ａｒｅ
ｔｅｒｔｉａｒｙｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｔｅｒｔｉａｒｙ
ｔｈｅｅｖｅｎ
ｌａｎｅｓ．Ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｏｆｅａｃｈｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ
ｐｒｉｍｅｒ
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ｎｏ
Ｗａｓ
ｒｅｐｅａｔｅｄｔｗｉｃｅ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｉｎｔｈｅ６ｔｈａｎｄ８ｔｈｌａｎｅｓ
ｐａｉｒｓ
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ｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｐｒｉｍｅｒ．Ｔｈｅｒｅ
ａｎｙｔｅｒｔｉａｒｙｐｒｏｄｕｃｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒ
ｏｆ
ｐｒｉｍｅｒｓ．
马玉银等：水稻小粒矮突变性状与Ｔ－ＤＮＡ插入标签的共分离检测
ＡＡＴＧＡＧＧｌ＇ＡＣＴＴＧＡＩ’ＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＴＡＡＡＡＡＣＴＣＣＣＧＣＡＡＧＴＧ丌ＡＴＡＡＧ丁ＴＧＴＣＡＡＧＣＧＴＣＡｒ几１＇ＡＣＴＧＣＡ
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ＴＣＡＴＴＣＡＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＡ
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／／
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８９４８８８９５７８８９６３７
Ｇｌ引物ＧＩｐｒｉｍｅｒ
一Ｔ－ＤＮＡ卜Ｇ２弓Ｉ物Ｇ２呻——◆
Ｔ引物Ｔｐｒｉｍｅｒ
ｓｉｔｅ
ｉｎｒｉｃｅ
图３Ｔ－ＤＮＡ在水稻基因组中的插入位置及相关的引物扩增位置和侧翼序列位置
ｇｅｎｏｍｅａｎｄｉｔｓｆｌａｎｋｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｆｉｇ．３．ＰｈｙｓｉｃａｌｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＴ—ＤＮＡｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ．
候选基因为水稻第７染色体上的ＢＡＣ号为Ｐ０５６７Ｈ０４中的第１４个预测基因；图下数字如８５６２７为Ｐ０５６７Ｈ０４上的第８５６２７ｂｐ的位置。
Ｔｈｅ
ｃａｔｉｏｎｏｆ
ｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｐａｉｒｂａｓｅ
ｏｎ
ｉｓｔｈｅ１４山ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｇｅｎｅ
ｏｎｔｈｅ
ＢＡＣＰ０５６７Ｈ０４
８５６２７
ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ｓｉｔｅ
７ｉｎｒｉｃｅ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｂｐ
ｉｎ
ｂｅｌｏｗｔｈｅＢＡＣｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ１０—
ｔｈｅＢＡＣ．Ｆｏｒ
ｅｘａｍｐｌｅ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒ
ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｏｆ８５６２７ｔｈｅＢＡＣＰ０５６７Ｈ０４．
第７染色体的编号为Ｐ０５６７Ｈ０４的ＢＡＣ中。根据Ｆｇｅｎｅｓｈ软件对该ＢＡＣ进行基因预测，结果表明该标签系中的一个插人点位于一个预测基因的第１个内含子中。
２．４侧翼序列共分离验证
合株也应该为阳性。
标突变性状分离、小粒矮突变纯合体）进行侧翼序列共分离检测，检测结果见表４。
根据上述的理论分析和本试验的结果，我们推测，确实存在至少２个Ｔ—ＤＮＡ插入事件，其中获得侧翼序列的插人事件与小粒矮的突变性状共分离。
２００６年秋季，我们在海南分别种植目标位点插人突变纯合株、杂合株和野生型植株的后代小区各检测所得侧翼序列是否与突变性状共分离，是本研究的关键。从理论上分析，在非串联多拷贝插入且非目标插入点为突变纯合的情况下，若所得侧翼序列是目标插入点的侧翼序列，则预期的共分离
中国水稻科学（ＣｈｉｎｅｓｅＪＲｉｃｅＳｃｉ）第２２卷第６期（２００８年１１月）
表４侧翼序列与突变性状共分离检测的ＰＣＲ检测结果（Ｔ３代）
Ｔａｂｌｅ４．ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｃｏ－ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｉｔｈｔｈｅｓｇｄ
ｍｕｔａｎｔｉｎ
Ｂ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．
小区号
Ｃｏｄｅｏｆｐｌｏｔ
。正嚣篡株，。阳嚣’篡株，篙翟。阳ＧＩ㈣＋Ｇ２６阴１锕㈣，可，黑基删’
（正常株ｔ突变株）
Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ
上代目标基因位点
（阳性株：阴性株）
Ｐａｉｒ
（阳性株：阴性株）
ｂｏｕｎｄａｒｙ
（阳性株：阴性株）
Ｇ１＋Ｇ２
ｐｒｉｍｅｒｓ
ｏｆＴｐｒｉｍｅｒｓ
ｌ
Ｇ２＋Ｔ
ｐｒｉｍｅｒｓ
（Ｗｉｌｄ
ｌ
Ｍｕｔａｎｔ）（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ）（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ）（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ）
ｉｎ
…
ｐｒｅｖｉｏｕｓｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｌ）
１９：３１８１６１２３３
ｉ
２２：０２４：０１９
１
１６：６１９１４
ｌ
１９１８１６
ｌ
３６３
Ａａ（ｂｂ）Ａａ（ｂｂ）
Ａａ（ｂｂ）
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ＡⅡ（ｂｂ）Ａｎ（ｂｂ）
ｌ
１３
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ＡＡ（ｂｂ）
４３：０
”假设存在２个插入事件。其中Ａ－ｎ位点为目标插入位点．Ｂ－ｂ位点为非目标插入位点。
”Ｔｗｏｉｎｓｅｒｔｉｏｎ
ｔｉｏｎ
ｓｉｔｅ．
ｅｖｅｎｔｓ
ｗｅｒｅ
ｓｕｐｐｏｓｅｄ
ｔｏｅｘｉｓｔｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．ＯｎｅｉｓＡ－ａ，ｔｈｅｔａｇｇｅｄｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｔｅ．ｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓＢ－ｂ。ｔｈｅｎｏｎ—ｔａｇｇｅｄｉｎｓｅｒ—
测，并且扩大了检测规模（Ｔｓ代），共检测了５６５株。其中突变体小区６６株，Ｔ引物对检测结果全为阳性，Ｇ２＋Ｔ引物对检测结果全为阳性，而Ｇ１＋Ｇ２引物对检测结果全为阴性（部分结果见图４一Ａ）。性状分离小区共检测了２７０株，Ｔ引物对检测结果全为阳性，Ｇ２＋Ｔ引物对检测结果阳性与阴性的比例为２０２：６８（Ｙ２＝０．００５＜Ｙ；ｎ５＝３．８４），Ｇｌ＋Ｇ２引物对检测结果阳性与阴性的比例为２０３：６７（ｘ２＝
步证实了我们获得的侧翼序列即为目的基因的侧翼序列。
３讨论
３．１
非串联多拷贝Ｔ－ＤＮＡ插入标签系的利用
应用Ｔ—ＤＮＡ标签法克隆基因，一般是选择单拷贝插入标签系作为研究对象，对于多拷贝插入的标签系，由于研究比较困难而较少被利用。
由于目前构建的水稻插入突变体库中存在大量组培变异的干扰，而且，有近一半的标签系中存在不止１个独立的插入事件Ｄ７３，因此，如何利用非串联低拷贝标签系克隆目的基因，对于提高突变体库的利用效率，具有重要的意义。实践中，对于非串联低拷贝标签系，只要思路清晰，仍有可以采用Ｔ—ＤＮＡ
０．００５＜ｘ３。５＝３．８４），并且所有分离小区内的全部
突变体植株，用Ｇ１＋Ｇ２引物对检测的结果全为阴性（部分结果见图４一Ｂ）。表型正常的小区检测了２２９株，Ｔ引物对检测结果全为阳性，Ｇ２＋Ｔ引物对检测结果全为阴性，而Ｇ１＋Ｇ２引物对检测结果则全为阳性（部分结果见图４一Ｃ）。此检测结果更进一
Ａ
Ｂ
Ｃ
图４典型株系侧翼序列与突变性状共分离检测
Ｆｉｇ．４．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｏ－ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｆｌａｎｋｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆｓｇｄｍｕｔａｎｔｉｎｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｌｉｎｅｓ．
Ａ－ｄ，粒矮突变体纯合小区；Ｂ一性状分离小区；Ｃ一表型正常小区。上、中、Ｔ｜ＩｉＥ分别为Ｇ１＋Ｇ２引物对，Ｇ２＋Ｔ引物对和Ｔ引物对扩增的电泳条带。
Ａ，ＢａｎｄＣｒｅｐｒｅｓｅｎｔ
ｒｏｗｓ
ｔｈｅｐｌｏｔｓｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｓｇｄｍｕｔａｎｔ
ｗｉｔｈ
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ｐａｉｒｐｒｉｍｅｒｓ
ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ
ａｎｄｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ
ｗｉｌｄ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ
ｆｒｏｍ
ｔｏｐ
ｔｏ
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ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
Ｇ１＋Ｇ２．Ｇ２＋Ｔａｎｄ
Ｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
马玉银等：水稻小粒矮突变性状与Ｔ—ＤＮＡ插入标签的共分离检测
标签法进行基因克隆［１８｜。如果能够在Ｔ１代对非串联多拷贝插入的标签系收获较多单株，便可能在Ｔ２代（最迟在Ｔ３代）获得只存在一个插入事件（处于杂合状态）且目标突变性状出现分离的后代株系。有了这样的株系则后续的共分离检测将与常规标签法的共分离检测结果完全一致。本研究组在这方面已经有过成功的实践［１８］。
本研究的情况有所不同。由于Ｔ１代获得表型正常的植株数量过少，导致Ｔ２代只有一个在目标突变性状上存在分离的株系，且该株系中一个与目标突变性状无关的插入事件已经纯合，使我们不能依据这个系来进行插入事件与突变性状的共分离检测。不过，即使在这样的情况下，我们采用ＴＡＩＬ－ＰＣＲ方法获得了插入点侧翼的基因组序列，进而证实获得的侧翼序列与目标突变性状共分离。我们的研究结果表明，可以发展多种研究思路，通过标签法从非串联低拷贝标签系中克隆目的基因。３．２侧翼序列与突变性状的共分离检测
在非串联多拷贝插入事件的情况下，确定侧翼序列是否是目的基因的侧翼序列尤为重要。因为在多拷贝的情况下，ＴＡＩＬ—ＰＣＲ的三级产物不一定为目标基因的侧翼序列。本研究组在研究另一些双拷贝插入标签系时，曾经仅仅获得了非目标位点的侧翼序列，并证明这些侧翼序列并不与突变性状共分离；而另一些ＴＡＩＬ—ＰＣＲ的三级产物却正好为目标位点的侧翼序列［１８ｌ。因此，必须进行侧翼序列与突变性状的共分离检测，以确定突变是否由Ｔ—ＤＮＡ插入引起。本研究在进行侧翼序列共分离验证时，发现所有的小粒矮突变体用Ｇ２＋Ｔ边界引物对检测，ＰＣＲ结果全为阳性，而用Ｇ１＋Ｇ２引物对检测全为阴性。Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５代性状分离小区的植株共４８３株用Ｇ２＋Ｔ边界引物对检测时，阳性植株与阴性植株的总分离比为３６３：１２０（Ｘ２一ｏ．００６＜ｘ６．０５＝３．８４），且突变体全为阳性。用Ｇ１＋Ｇ２引物对检测时阳性植株与阴性植株的总分离比为３６４：１１９（）［２＝０．０３４＜ｘ８．０５＝３．８４），且突变体全为阴性。表型正常的小区用Ｇ＋Ｔ边界引物对检测结果全为阴性，而用Ｇ１＋Ｇ２引物对检测结果全为阳性。这一结果说明，即使基于插入标签的特异ＰＣＲ无法检测目标突变性状是否与插人事件共分离时，仍可能通过获得插入点侧翼的基因组序列来进行共分离检测，仍有可能通过Ｔ—ＤＮＡ标签法来鉴定和克隆重要的功能基因。
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水稻小粒矮突变性状与T-DNA插入标签的共分离检测
作者：
马玉银， 张亚芳， 潘存红， 李爱宏， 吴旭江， 左示敏， 陈宗祥， 吴昌银， 潘学彪， MA Yu-yin， ZHANG Ya-fang， PAN Cun-hong， LI Ai-hong， Wu Xu-jiang， ZuoShi-min， CHEN Zong-xiang， WU Chang-yin， PAN Xue-biao
马玉银,MA Yu-yin(扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室/植物功能基因组学教育部重点实验室,江苏扬州225009;扬州教育学院生物化学系,江苏扬州225002)， 张亚芳,李爱宏,吴旭江,左示敏,陈宗祥,潘学彪,ZHANG Ya-fang,LI Ai-hong,Wu Xu-jiang,Zuo Shi-min,CHENZong-xiang,PAN Xue-biao(扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室/植物功能基因组学教育部重点实验室,江苏扬州,225009)， 潘存红,吴昌银,PAN Cun-hong,WU Chang-yin(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,湖北武汉,430070)中国水稻科学
CHINESE JOURNAL OF RICE SCIENCE2008，22(6)1次
作者单位：
刊名：英文刊名：年，卷(期)：引用次数：
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1.学位论文 董玉梅 水稻启动子捕获及T-DNA标签技术的研究 2007
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是禾谷类作物分子生物学研究的模式植物。随着水稻基因组测序工作的完成，水稻研究进入了功能基因组的研究，其主要途径之一是建立大规模的突变体库。 本论文主要是利用农杆菌介导的遗传转化，通过T—DNA的随机插入产生水稻突变体，并对突变体进行鉴定和分析。同时，在T—DNA区域右边界构建了一个不带启动子的GUS基因，用来捕获水稻的启动子。得到393株转基因植株，通过PCR检测、Southern杂交方法进行部份植株检测，阳性率达100﹪，Southern杂交拷贝数为1-4个。我们对393株转基因植株的叶、根、胚乳和胚芽鞘进行了GUS组织化学染色，基因捕捉率分别为5.34﹪、1.78﹪、10.17﹪、6.36﹪。利用PCR步行法对12株染色的植株T—DNA插入侧翼序列进行分析，目前测出8株，与水稻基因组同源性都高达90﹪以上。 对65株转基因植株T1代进行观察分析，其中有18株有突变表型：矮杆、半矮杆、不育、半不育、单蘖、多蘖、颖壳白斑、小穗、叶片扭曲。用Genome walking法进行侧翼序列的扩增，目前测出5株，并对这5株扩出的序列在GenBank中进行BLAST分析，得到了插入位点侧翼序列的相关信息，如T—DNA插入在染色体上的位置，可能的编码蛋白等。 通过本实验，建立了农杆菌介导的水稻再生体系及T—DNA插入侧翼序列测定技术，为进一步的研究奠定了基础。
2.期刊论文 李爱宏.张亚芳.吴昌银.汤雯.武茹.戴正元.刘广青.张洪熙.潘学彪.LI Ai-Hong.ZHANG Ya-Fang.WUChang-Yin.TANG Wen.WU Ru.DAI Zheng-Yuan.LIU Guang-Qing.ZHANG Hong-Xi.PAN Xue-Biao 水稻T-DNA插入突变体库的筛选及遗传分析 -遗传学报2006,33(4)
T-DNA标签技术是分离和研究植物功能基因的有效方法,寻找T-DNA插入表型突变体是进一步开展研究的关键所在.文章对以ZH11、ZH15为受体亲本构建的4416份T1代标签系进行了表型鉴定,发现存在拟纯合突变和系内分离突变两种类型,突变表型涉及株高、生育期、叶形、叶色、分蘖力、植株松紧度、穗颈节、穗形、颖花、粒形、类病变、雄性不育、生长极性等14类性状.其中,株高、生育期、叶色、雄性不育有着相对较高的突变频率(超过1%),株高和叶色的突变频率在品种及年度间表现稳定,而生育期、雄性不育波动较大,表明这类性状的表型易受到环境的影响.通过T1、T2连续世代的共分离分析,筛选出3个与穗部或颖花发育相关的T-DNA插入突变体,为分离相关功能基因奠定基础.随机选择42份有表型突变的标签系,通过质粒拯救和TAIL-PCR的方法分离其侧翼序列,从39个标签系中获得40条序列,其中25条为载体序列,14条与水稻基因组有很好的同源性,BlastN分析结果表明T-DNA有优先整合进植物功能基因内部的特性.
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgsdkx200806003.aspx
下载时间：2009年11月20日