药剂学专业实验论文
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二零一三年九月
复方双黄连胶囊的研制
【摘要】真空干燥器的使用，：目的:掌握常用的中药提取的方法和原理、掌握旋转蒸发仪、
掌握湿法制粒和胶囊剂制备的过程和技术，分析处方的组成和各种辅料的作用；掌握胶囊剂项下的质量检查项目和检查方法；掌握薄层色谱的操作技术，崩解仪、紫外分光光度计的使用；掌握双黄连胶囊的药效学研究，学习抗炎药物的筛选方法。方法：溶剂提取法提取黄芩、连翘和金银花，湿法制粒法制备胶囊，薄层色谱法进行胶囊剂鉴别，使用崩解仪测定胶囊的崩解时限，双波长分光光度法测定双黄连胶囊中黄芩苷含量，用小鼠耳肿胀模型进行双黄连胶囊的药效学研究。结果：制备得到了复方双黄连胶囊30粒，胶囊质量符合要求，制备的胶囊具有抗炎作用。结论:通过以上制备方法完全可以制备出合格的复方双黄连胶囊，该胶囊具抗炎作用，且药量越大，抗炎效果越好。
【关键词】：复方双黄连，溶剂提取法，湿法制粒，鉴别，检查，含量测定，药效学
Preparation of compound Shuanghuanglian capsules
Abstract：Objective To master the commonly used extraction methods and principles of traditional Chinese medicine,to master the methods and principles of wet granulation; to master the methods for the examination of the quality of the capsules and pharmacodynamic research methods; to master Thin layer chromatography technique and the use of Disintegration apparatus and Uv spect rophotometry..Methods Chinese medicine –Jinyinhua、Lianqiao and Huangqing were extracted using the method of decocting.The capsules were prepared by wet granulating.and identified using the method of TLC identification.The disintegration time of the capsules was examed using Disintegration apparatus. The content of Huangqingan in compound Shuanghuanglian capsules was determined using the method of dual wavelength spectrophotometry. The research of pharmacodynamics of compound Shuanghuanglian capsules was conducted using the model of mouse ear inflammation. Results We got forty compound Shuanghuanglian capsules that conform to the quality criterion and have anti-inflammatory effect.Conclusion We can prepare compound Shuanghuanglian capsules that conform to the quality criterion with the methods above.These capsules have anti-inflammatory effect ,besides,the greater dose ,the better anti-inflammatory effect it has.
compound Shuanghuanglian capsules， the method of decocting , wet Keywords：
granulation , identification, examination , content determination , pharmacodynamics 引言
双黄连胶囊是日常感冒的常备药，它的主要成分是黄芩、连翘、金银花，它具有辛凉解表，清热解毒功效，常用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛。本次试验选用溶剂提取法（水煎法等）提取金银花、连翘和黄芩，采用湿法制粒的工艺制备胶囊，采用薄层鉴别法进行胶
囊剂鉴别，使用崩解仪测定胶囊的崩解时限，双波长分光光度法测定双黄连胶囊中黄芩苷含量，用小鼠耳肿胀模型进行双黄连胶囊的药效学研究。该实验贯穿天然药物化学、药剂学、药物分析和药理学四大药剂专业主干课程，通过本次实验，能够更加深刻地理解和巩固在课堂中所学到理论知识，掌握药物制剂过程中常用仪器设备的使用方法，掌握各专业实验的基本操作和基本技能，具备一定的分析问题、设计方案、解决问题和独立工作的能力，熟悉新药研发的基本思路，为将来从事药物制剂的生产、研究、开发及相关工作打下良好的基础。 实验部分
1材料
1.1 仪器及试剂
1、仪器
LD5-2A低速离心机、GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）、B型玻璃仪器气体烘干仪、SHR-Ⅲ循环水式多用真空泵、KH-2500B型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、HH-4数显恒温水浴锅（常州市华普达教学仪器有限公司）、YH-1通风柜（青岛岳海实验室设备有限公司）、蒸煮锅、KDM型调温加热套（龙口市电炉制造厂）、电热炉、紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、粉碎机、BJ-1崩解时限测试仪（天津市国铭医药设备有限公司）、布氏漏斗、漏斗、离心管、玻璃棒、蒸发皿、纱布、试管、研钵、容量瓶（100ml、10ml）、分液漏斗（250ml）、密度计（黄骅市滨海玻璃仪器厂）、胶头滴管、洗耳球、14目筛、16目筛、FA12048电子天平、YP202N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、YP601ND电子天平、小铝盆、不锈钢托盘、胶囊板、滤纸、展开缸、玻璃板、量筒（100ml、10ml）、烧杯（1000ml、500ml、200ml、100ml）、灌胃器、剪刀、打眼器、喷壶。
2、试剂
黄芩对照药材溶液、黄芩苷对照品溶液、金银花对照药材溶液、绿原酸对照品溶液、连翘对照药材溶液、连翘苷对照品溶液、氨制硝酸银溶液、10%硫酸乙醇溶液、盐酸酸化的5%FeCl3乙醇溶液、醋酸乙酯（分析纯）、甲醇（分析纯）、50%甲醇、正丁醇（分析纯）、冰醋酸、三氯甲烷（分析纯）、蒸馏水（分析纯）、二甲苯、双黄连水溶液、2mol/LHCl、75%乙醇、80%乙醇、无水乙醇、硅胶、羧甲基纤维素钠
1.2 动物
健康雄性小白鼠4只，重量20g左右
1.3 药物
主药：黄芩（产地：山东，产品批号：100301）、连翘（产地：山西，产品批号：120601）、金银花（产地：河南，产品批号：100908）
药用辅料：硬脂酸镁、淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、0号胶囊壳（浙江新昌县天林化工胶囊有限公司）。
2 方法
2.2．黄芩、连翘和金银花的提取
2.1.1.黄芩的提取
称取黄芩75g，放入蒸煮锅内，加入适量水（没过药材1-2cm），用电热炉小火加热，保持微沸。水煎煮2小时后停止，滤过（2层纱布），取滤液于500ml烧杯中。药渣继续加适量水煎煮30min，滤过（2层纱布），合并两次滤液。将蒸煮锅刷洗干净，并将所得的滤液倒入其中，于电热炉上浓缩，浓缩成约100毫升左右的浸膏。用密度计测量其相对密度为1.057（80℃），并在水浴锅上保持80℃用2mol/LHCl调节PH至1.0-2.0之间，在水浴锅上保温1小时，然后再在室温下静置24小时，得到下层为土黄色的膏状物质，上层为棕红色液体。用胶头滴管小心弃去上层液体，向盛有土黄色膏状物质的烧杯中加入适量蒸馏水，用玻璃棒搅匀，倒入布氏漏斗中抽滤，用PH试纸测试溶液PH=3，取出滤饼，放入烧杯中再加入蒸馏水若干搅匀，再用布氏漏斗抽滤，取出滤饼，测试溶液的PH，重复以上步骤，抽滤处理共4次。最终，PH调至5.0，然后再用80%的醇洗，按以上步骤，洗至PH接近7.0，醇洗2次，得到的沉淀用玻璃棒转移至100ml烧杯，两个蒸发皿中，放入烘箱中，恒温60摄氏度，干燥研细备用。
2.1.2.金银花、连翘的提取
称取金银花75g，连翘150g，预留6-12g干药材粉碎备用（金银花8.0g，连翘16.0g）。将连翘和金银花混合药材放入蒸煮锅内，加入适量水（没过药材1-2cm），用电热炉小火加热，保持微沸。水煎煮1.5h后停止，滤过（2层纱布），取滤液于500ml烧杯中。药渣继续加适量水煎煮1.5h，滤过（2层纱布），合并两次滤液。将蒸煮锅刷洗干净，并将所得的滤液倒入其中，于电热炉上浓缩，浓缩成约160mL的清膏，用密度计测量其相对密度为
1.20-1.25（80℃）（未测相对密度，只是凭老师指导和实验经验）。室温冷却至40℃时，搅拌下缓缓加入乙醇480mL,使含醇量达75%。充分搅拌，静置12小时，过滤，将残渣中加入75%乙醇适量，搅拌，静置5小时，过滤，合并两次滤液，回收乙醇至无醇味。将其浓缩成相对密度为1.34-1.40（60℃测）的稠膏（未测相对密度，只是凭老师指导和实验经验）。
2.2.双黄连胶囊的制备
1．处方组成： 提取的黄芩粉末 8.7g
金银花、连翘粉碎粉末 22.2g
金银花、连翘稠膏 所提取量
淀粉 5.0g
羧甲基淀粉钠 5.0g
硬脂酸镁 2.0g
乙醇 适量
制备80粒
2. 制法：将上述制得的金银花、连翘稠膏微热，向其中加入预留的金银花连翘粉末，并
且迅速用玻璃棒搅拌均匀，然后采用等量递加的方法加入提取的黄芩粉末，搅匀，使成大小不一团块状，可用粉碎机粉碎成较小的颗粒。加等量递加淀粉，羧甲基淀粉钠、及硬脂酸镁适量，搅拌均匀，用喷雾法喷入无水乙醇适量，迅速用手搅拌均匀并制成软材，过16目筛，湿粒在60℃温度下烘干，干粒过14目筛整粒，最后用胶囊板装入胶囊壳制备胶囊。
2.3 复方双黄连胶囊的鉴别、质量检查和含量测定
2.3.1 复方双黄连胶囊的质量检查
1、装量差异：取14粒胶囊，分别精密称定重量后，倾出内容物（不得损失囊壳），囊壳
用小刷拭净，置通风处使溶剂自然挥尽，再分别精密称定囊壳重量，求出每粒内容物的装量与平均装量。每粒的装量与平均装量相比较，超出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度1倍。
平均装量 重量差异限度
0.3g以下 ±10％
0.3g或0.3g以上 ±7.5％
2、崩解时限：取供试品6粒，按《中国药典》2010年版二部附录XA进行崩解时限检查。硬胶囊应在30min内全部崩解。如有1粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。
2.3.2 复方双黄连胶囊的鉴别
1．黄芩的鉴别
供试液的制备：取双黄连胶囊4g，甲醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至近干，加甲醇2mL使溶解。
黄芩对照药材溶液的制备： 黄芩对照药材1g，同上法，制成黄芩对照药材溶液。 黄芩对照品：精密称定，加甲醇制成1mg/mL的溶液。
TLC：点样量各2μL，硅胶薄层板（硅胶3g、羧甲基纤维素10mL）
展开剂：正丁醇：冰醋酸：水（7:1:2）,展开，晾干，喷以盐酸酸化的5%FeCl3乙醇溶液，供试品色谱中，在与黄芩对照药材和黄芩对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 2． 金银花的鉴别
供试品的制备：取双黄连胶囊4g，加热水40mL使溶解，加醋酸乙酯提取两次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取的水溶液，加0.3ml2M的盐酸溶液调节pH至1.0，用醋酸乙酯提取二次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2mL，使溶解，滤过，滤液作供试品溶液。
金银花对照药材溶液的制备：金银花对照药材5g，加水50mL，煎煮1h，滤过，滤液加盐酸调节pH至1.0，同法制成金银花对照药材溶液。
绿原酸对照品溶液的制备：精密称定，加甲醇制成1mg/mL的溶液
TCL: 点样量各2μL,硅胶G薄层板（用前活化处理）
展开剂：醋酸丁酯：甲酸：水（7：2.5：2.5）的上层溶液为展开剂，展开，晾干喷以氨制硝酸银试液，立即检视。供试品色谱中，在与金银花对照药材和绿原酸对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3．连翘的鉴别
供试品溶液的制备：双黄连颗粒4g，研细，加75%乙醇10ml，超声处理10min，滤过，滤液作为供试品溶液
连翘对照药材溶液的制备：取连翘对照药材0.5g，加甲醇10mL，置水浴上加热回流20min，滤过，滤液作为对照药材溶液。
TLC：吸取对照药材溶液供试品各2μL，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（5:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.3.3. 复方双黄连胶囊含量测定
对照品溶液的制备：精密称取真空干燥至恒温的黄芩苷对照品12.5mg置50mL容量瓶中，加50%甲醇适量，置水浴中振摇，使溶解，放置至室温，稀释至刻度即得浓度为0.25mg/mL的溶液。
供试品溶液的制备：取重量差异下双黄连颗粒研细，用电子天平称取供试品M=3.0000g，置100ml容量瓶中加50%甲醇适量，超声处理20min，放置至室温，稀释至刻度，摇匀。滤过，精密量取滤液2ml置100ml容量瓶中至刻度，摇匀，滤过，再精密量取续滤液2ml置100ml容量瓶中摇匀。滤过，精密量取滤液1ml置10ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀即得。
标准曲线的绘制：精密量取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml,分别置100ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，于277nm和377nm波长处分别测吸光度A值，并且计算△A，以△A对浓度y进行线性回归，得标准曲线方程。(本实验参考标准曲线为y=75.78x-0.0245 r=0.9994)
供试品吸光度测定：取供试品溶液于277nm和377nm波长处分别测吸光度，分别为A¹、A²，得△A=A¹－A²，根据回归方程计算样品中黄芩苷的含量。
2.4 复方双黄连胶囊的药效研究
选用健康雄性小白鼠4只，称重，并分别用苦味酸标记。随机分成给药组（1号，2号，3号）和对照组，并且标号。每鼠左耳两面涂二甲苯约0.02mL，右耳做空白对照。分别取0.0836g，0.1672g，0.2508g药配成7ml溶液,并且分别标上标签1号，2号，3号。30min后，两组分别灌胃给药0.7ml(最大给药量为0.3ml/10g)。给药组：取相对应的配置的1号，2号，3号药液灌胃。对照组：给等量蒸馏水（代替生理盐水）。4h后，将小鼠处死，剪下双耳并在同一部位打圆耳片，扭力天平称重，以（左耳重-右耳重）/右耳重 作为肿胀率，比较差异。
3 结果与讨论
3.1．黄芩、连翘和金银花的提取
【结果】
提取得到黄芩粉末8.7g，一定量金银花、连翘稠膏。
【讨论】
1、水煎法提取出的连翘，金银花，黄芩的量相对超声提取法、回流提取法等其他溶剂提取法得到的量较多，并且设备简单，操作简单，是中药提取的好方法。
但同时要注意的是：提取出的药量大，多糖、鞣质等杂质也较多，多糖等成分粘性很大，会造成后期制粒时软材粘性过大，影响制粒。
2、煎煮时要注意补充水分，保持药液微沸即可，不要过大的火力加热，并且在煎煮过程中经常用玻璃棒搅拌，防止药材煎糊使药物有效成分减少，产生毒副物质。
3、黄芩提取过程中，采取80℃保温一小时的措施，目的是便于黄芩苷的析出，凝集成较大的颗粒易于沉降和过滤，注意保温尽量保持静止稳定，使之充分受热沉降。
3.2．双黄连胶囊的制备
【讨论】
1、 制软材和制湿粒的过程中出现较多问题：
①在制软材时候，由于没有预先查好资料，导致崩解剂羧甲基淀粉钠和润滑剂硬脂酸镁过早的加入，影响了其崩解和润滑效果，这样不但不能加快胶囊崩解，而且还会延迟胶囊崩解。
②由于采用水煎法提取的金银花和连翘，因此含多糖、鞣质等杂质比较多，而多糖等的粘性本身就很大，并且加入辅料的次序及用量不太恰当，金银花连翘稠膏过于黏稠，其中的水分太少，导致在制备软材的过程中，加入黄芩、金银花连翘药材粉末和各种辅料的时候，越搅拌粘性越大，最后直接搅拌不了，并且冷却后制备的软材特别硬（像石头
一样硬）。制软材失败，只能用粉碎机将其粉碎，然后再加辅料进行制备。
③制湿粒时，经过反复过筛、加辅料、用手混合的过程才勉强制成的。由于没有掌握好制备软材和湿粒的技巧，导致在此过程中浪费了大量的药材和辅料。
④由于提取的金银花和连翘稠膏本身粘性就很大，所以在选择辅料的时候就要选择粘性不大的辅料，如微晶纤维素，和稀释剂淀粉。
⑤我认为要想得到比较理想的软材和湿粒除了要掌握相应的理论知识以外，更重要的是需要一定的制备软材的经验。有时候，辅料多一点或者是少一点都会导致软材的制备失败，因此，我们就需要多加练习，积累制备经验。
2、 处方分析：
金银花+黄芩+连翘粉 主药
微晶纤维素 填充剂和粘合剂
羧甲基淀粉钠 崩解剂
硬质酸镁 润滑剂
乙醇 润湿剂
淀粉 填充剂和稀释剂
3.3 复方双黄连胶囊的鉴别、质量检查和含量测定结果
3.3.1.复方双黄连胶囊的质量检查结果
1、装量差异结果
胶囊总重量：6.5005g 胶囊平均重量：0.4643g 胶囊壳重量：1.3942g 囊壳平均重量：0.0996g
表3-3-1 胶囊装量差异统计
由以上数据可得：本组胶囊的平均装量均＞0.3g，装量差异均在±7.5%范围内，因此本组胶囊装量差异符合要求。
2、崩解时限结果
6粒胶囊崩解时限：4min内全部崩解
【讨论】
由以上数据可得：本组胶囊均在30min之内崩解完全，因此崩解时限符合规定。
3.3.2 复方双黄连胶囊的鉴别结果
连翘薄层鉴别结果如下： 金银花波层鉴别结果如下：
黄芩薄层鉴别结果如下：
【讨论】
1、 连翘：如以上薄层层析结果所示，供试品与连翘对照药材和连翘苷对照品色谱相应的位
置上，显相同颜色（紫黑色）的斑点，即制备的复方双黄连胶囊中含有连翘。
2、 金银花：如以上薄层层析结果所示，供试品的薄层结果为3个斑点(棕黄色)，而金银花
对照药材只出现一个斑点，绿原酸对照品没有出现斑点。这样的结果不能说明制备的复方双黄连胶囊中含有金银花。
分析其原因：①点样的过程中，点样量过低②配制的金银花对照黄芩苷药材溶液和和绿原酸对照品溶液有问题，可能在配制的过程中出现差错。
3、 黄芩：如以上薄层层析结果所示，供试品与对照药材均出现3个斑点（绿色），但是不
是在相应位置上，对照药材出现的斑点的Rf值比对应的供试品斑点的Rf值大，即对照药材在薄层板上跑的比较快。原因分析：在薄层板展开的过程中，薄层板没有放平，导致对照药材一边展开速度比较快。黄芩苷对照品的斑点极其浅，几乎看不到。原因可能是点样量过少或是黄芩苷对照品溶液的配置有问题。这样也稍微能够得出制备的复方双黄连胶囊中含有黄芩。
4、 在展开前，应该将展开缸用展开剂进行预饱和，防止在展开的过程中出现边缘效应。并
且，在展开前，应该振摇展开剂，否则展开剂会出现分层现象，影响展开效果。
3.3.3. 复方双黄连胶囊含量测定结果
1、标准曲线方程：y=0.0332△A +0.0061，R2=0.9979
表3-3-3 供试品吸光度测定结果
波长（nm） 277 吸光度A 0.356 △A(A¹－A²) 0.286 377 0.070
2、黄芩苷的含量%计算
代入标准曲线计算公式得黄芩苷浓度：y=0.0156mg/ml
稀释倍数为：50000倍
黄芩苷的重量计算：
m=y×50000=0.0156×50000=780g,即0.78g
黄芩苷的含量计算：
黄芩苷的含量%=m/M×100%=0.78/3.0000×100%=26.0%
【讨论】
1、 一般情况下，每粒胶囊中黄芩苷的量为≥50mg，含量约为11.6%,可见制备的复方双黄连
胶囊黄芩苷的含量偏高。之所以偏高是因为，在制软材的时候，加的辅料量太少。
2、 含量测定的时候，本来制备的黄芩苷溶液稀释倍数为5000倍，但是由于所测得的吸光
度A值为2.345，而正常情况下A值的范围为0.3－0.7，A值太大，影响吸光度的精确性，因此又稀释了10倍。
3.4 复方双黄连胶囊的药效研究结果
编号
小鼠重量\g
空白 21.79 表3-4-1 4只小鼠的重量 1号 2号 21.81 23.30 3号 24.08
因为4只小鼠重量均接近22g,因此近似取小鼠的重量为22g来计算每只小鼠的给药量。并且，一般一粒双黄连胶囊约为0.53g,黄芩苷含量约为50mg，而制备的黄芩苷为26.0%，换
算出来的含黄芩苷为50mg的胶囊剂为0.19g。
给药量分别为：
1号：(0.19g×2×3/75000g)×22g×25＝0.00836g
2号：(0.19g×2×3/75000g)×22g×50＝0.01672g
3号：(0.19g×2×3/75000g)×22g×75＝0.02508g
表3-4-2 4组小鼠肿胀率结果
编号 小鼠给药量\g 左耳重\g 右耳重\g
空白 0.00000 0.0088 0.0048 1号 0.00836 0.0065 0.0050
2号 0.01672 0.0058 0.0046
3号 0.02508 0.0053 0.0048
肿胀率\％ 83.3 30.0 26.1 10.4 83.3
30.0
26.1
10.4 55.4 36.8 27.6 3.5 55.36 12.24 10.64 7.84 44.64 27.27 18.37 12.50 291.4 109.1 96.1 70.7 87.7 62.3 6.7 0
空白 小剂量 中剂量 大剂量 50.88 50.88 28.8 28.33 28.33 17.54 17.54 5.45 5.45 5.7 3.5 -3.5
【讨论】、、=
通过上述数据可知，（1）给药组比对照组的小鼠左右耳重量差异小，即肿胀率小：（2）给药量越大，小鼠左右耳重量差异越小，即肿胀率越小，药物消炎效果越好。
4 结论
本实验采用水煎提取法提取黄芩、连翘、金银花，方法简便可行，采用湿法制粒制备得到了复方双黄连胶囊40粒，胶囊质量符合要求，制备工艺简单，制备的胶囊具有抗炎作用，且在一定范围内，给药量越大，抗炎效果越好。
参考文献
[1] 老师提供的讲义
[2] 2010版《中国药典》
[3] 网上查询的相关资料