CHIN J FORENSIC MED2016第31卷第6期
• 技术与应用•
法医学DNA 提取试剂盒优化及适用性评价
姚伊人1，白 雪1，徐纪民2，王友政2，喻永敏2，张思思1，赵兴春1
（1. 公安部物证鉴定中心，北京 100038；2. 重庆市公安局物证鉴定中心，重庆400707）
【摘要】目的 用磁性纳米磁珠和自主设计的试剂体系及提取流程，来建立一种基因组DNA 的快速提取优化方案。方法 利用自主研制的法医DNA 提取纯化试剂盒设计实验方案对陈旧棉签血样进行DNA 提取，用紫外分光光度计分析定量，通过对实验结果进行分析比较进一步优化自主研发的法医学DNA 提取试剂盒。用优化之后的试剂盒提取各种不同的疑难捡材，探索本试剂盒的适用性。结果 通过优化试验条件，同样获得了各种检材理想的DNA 提取效果，却大大降低了DNA 样本的提取成本。结论 经优化过的国产磁珠DNA 提取试剂盒完全可以应用与法医DNA 检测中。
【关键词】法医物证学；DNA 提取；磁珠法； STR分型
【中图分类号】DF795.1 【文献标识码】B 【文章编号】1001-5728（2016）06-0595-04doi: 10.13618/j.issn.1001-5728.2016.06.016
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Optimization of a forensic DNA extraction kits and its applicability evaluation (Yao Yiren, Bai Xue,Xu
Jimin 2 ,Wang Youzheng2 ,Yu Yongmin2,Zhang Sisi1,Zhao Xingchun1/1.Ministry of publicsecurity forensic science institute,Beijing 100038, China; 2. Chongqing Public Security Bureau Forensic Science Institute, Chongqing 400707, China )
【Abstract 】Objective To construct a rapid genetic DNA extraction method, with nano magnetic beads, self-designed reagents system and extracting process. Method Part I: DNA extraction from old blood cotton swab sample with self-designed DNA extraction kit, then quantified by UV spectrophotometer. The method was further optimized on the preliminary results. Part II: All kinds of difficult DNA sample were tested with optimized kit, to detect the applicability of the kit. Result By improving the experimental condition, the extraction effects of different DNA sample is good, meanwhile, the extraction cost is relatively low.
【Key words】forensic biological evidence; DNA extraction; magnetic beads;STR
DNA 的抽提方法如酚-氯仿法、盐析法、滤膜离心柱法等，都只能用于人工提取，不适用于自动化操作。DNA 提取目前常用磁珠法，该方法无需离心和有毒性有机溶剂，且适合于自动化操作。但缺点是所得DNA 纯度易受磁珠残留影响，裂解时间、样本量和乙醇浓度等因素也都有可能影响DNA 提取效果。因此，正确分析各影响因素的作用，才能获得最佳提取效果。本研究拟利用正交设计方法快速高效地摸索试验条件，建立DNA 提取最优方案。
1.2 试剂与仪器
自主研制的法医DNA 提取纯化试剂盒（公安部物证鉴定中心，中国）；无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，中国) ；Identifiler PCR扩增试剂盒（Life technology公司，美国）；DNA Typer 19 荧光检测试剂盒（公安部物证鉴定中心，中国）；MagAttract@ M48 DNA Manual Kit(QIAGEN公司，美国) ；Nano drop 2000微量紫外分光光度计(Thermo公司，美国) ；离心机(Thermo公司，美国) ；恒温混匀仪（Eppendorf 公司，德国）； 9700 PCR仪（Life technology公司，美国）； 3130XL遗传分析仪（Life technology公司，美国）。1.3 方法
1.3.1 DNA 提取试剂盒优化
在确定其他参数不变的情况下，对DNA 提取试剂盒关键组成部分：磁珠粒径、磁珠加入量、乙醇与洗涤液Ⅱ配比分别进行改变并测试。提取陈旧血棉签DNA 通过微量紫外分光光度计测所提取DNA 浓度以及
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1 材料与方法
1.1 材料
血棉签、唾液棉签、纱布、卫生纸、血卡、手直接接触棉签、手机鼠标、烟头等不同捡材的DNA 样本。
【作者简介】姚伊人，男，助理研究员，硕士，主要从事法医遗传学研究工作。E-mail: [email protected]
万方数据
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OD260/OD280值，对比得出最优方案。1.3.2 DNA 提取
（1）将适量捡材剪碎放入1.5mL 离心管中，加入200μL 裂解液，10μL 蛋白酶K ；（2）涡旋震荡5~10s,56℃孵育1h ，孵育过程中需多次震荡（; 3）13000rpm 离心5min, 转移上清液到1.5mL 离心管中；（4）在离心管中加入3倍体积的结合液，摇匀磁珠，加入30μL 磁珠充分混匀，吸附15min （每2min 混匀一次）；（5）混匀后将样品放在磁力架上，使磁力架和样品颠倒2~3次，吸出溶液加500μL 洗涤液Ⅰ，摇匀样品溶液放在磁力架上颠倒2~3次后吸出溶液。（吸出溶液时保持离心管紧贴磁力架，枪头不要碰到磁珠，同时要吸取管盖液体）；（6）加入500μL 洗涤液Ⅱ，摇匀样品溶液放在磁力架上，颠倒2~3次吸出溶液；（7）重复步骤6 1~2次，最后一次洗涤吸出所有洗涤液；（8）将离心管置于磁力架上，打开管盖室温晾干8min ；（9）加入30~100μL 洗脱液，65℃加热10min ，期间漩涡震荡2~3次；（10）从金属浴上取下离心管，在磁力架上将溶液转移到新的离心管，4或-20℃储存。1.3.3 DNA 定量
提取得到的DNA 样品用Nano drop 2000微量紫外分光光度计定量，并检测OD260/OD280值，操作参照仪器说明书。1.3.4 PCR及电泳检测
参照Identifiler PCR扩增试剂盒及DNATyper 19plus 试剂盒说明书，用9700 型PC Ｒ 仪进行复合扩增，3130 XL 遗传分析仪电泳检测，Genemapper 3. 2 对结果进行基因分型。
2 结 果
2.1 磁珠粒径优化
本次研究选取了200nm 、1μm 、5μm 3种不同粒径的磁珠，其悬浊液浓度相同，磁珠悬浊液加入量为30μL ，乙醇与洗涤液Ⅱ配比为1:1。每种粒径的磁珠各提取5份血量相同的血棉签样本，紫外分光光度计定量结果如表1所示。从表1中可以看出直径为5μm 的磁珠对陈旧血棉签样本的吸附效果最好。2.2 磁珠加入量
确定磁珠粒径为5μm 之后，用5μm 的磁珠提取血量相同的血棉签样本，磁珠加入量分别为20μL 、30μL 、40μL 、50μL ，乙醇与洗涤液Ⅱ配比暂定为1:1。每个加入量提取8个样本，紫外分光光度计定量计算
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万方数据
平均值结果如图表2所示。从图2中得出当磁珠加入量小于40μL ，DNA 浓度随着加入量的增加呈正比增长，大于40μL 以后DNA 浓度增长平缓，因此40μL 为磁珠悬浊液的最佳加入量。
表1 3种粒径的磁珠所提取到的DNA 样本量及纯度
磁珠直径样本编号浓度ng/μL 260/280
216.01.65317.81.57415.71.65516.4
1.571um 66.6
3.00711.12.3588.22.3597.22.18106.9
2.445um 1138.3
1.481243.01.461349.51.461439.71.45
图1 DNA 浓度随磁珠加入量变化图
2.3 乙醇与洗涤液Ⅱ配比
确定磁珠粒径为5um ，磁珠加入量为40μL 。其他实验条件不变，选择几种洗涤液Ⅱ和乙醇的不同配比提取陈旧血棉签样本DNA ，用紫外分光光度计得到表2 结果，从表中可以看出洗涤液Ⅱ和乙醇比例为3:7时DNA 浓度以及260/280的比值均优于其他配比浓度。2.4 与进口试剂盒MagAttract M48 DNA Manual Kit 的对比
取血斑同样大小的FTA 血卡片（5mm ×5mm ）8张，用两种试剂盒分别提取DNA ，对提取样本进行定量，定量结果如表3所示，浓度大小差异不显著，但是M48试剂盒所提取的DNA 样本OD260/280值普遍高于自主研发的法医DNA 提取纯化试剂盒。两种试剂盒所提取的DNA 样本检测后各基因座出峰完整，所得分型均能达到分析要求，但M48提取样本DNA 扩增检测结果的荧光峰RFU 值略高于法医DNA 提取纯化试剂盒提取样本。
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表2 洗涤液Ⅱ和乙醇配比对DNA 提取浓度及纯度的影响
样本编号浓度ng/μL 乙醇配比130361311.651.[1**********].061.[1**********].011.[1**********].401.704：1
13036098.101.5913036087.051.9713036076.331.80 1303608 4.71 1.78 1304206 5.62 1.693:7
1303281 19.38 1.75 1303401 14.51 2.12 1303279 11.87 1.74 1303403 15.32 1.69 1303646 10.30 1.621：1
130273816.831.[1**********].991.[1**********].911.[1**********].111.521303406
15.7
1.57
表3 两种DNA 提取试剂盒提取效能
样本编号
MagAttract@ M48 法医DNA 提取纯DNA Manual Kit 化试剂盒浓度260/280浓度260/280224.71.7722.61.67319.11.8221.71.67422.11.7918.61.62517.91.7720.11.69622.21.7518.61.58729.31.8124.21.652.5 法医DNA 提取纯化试剂盒适用性评价
优化条件之后，用法医DNA 提取纯化试剂盒提取办案中常见捡材；血棉签、纱布、卫生纸、血卡、唾液棉签、手直接接触棉签、手机擦拭物、烟头等不同检材的DNA 样本，均获得完整的数据分型结果。
3 讨 论
磁珠作为纯化实验的重要组成部分，由于其特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定、以及DNA 、RNA 的分离[1-3]。磁球在溶液中有较好的扩散性，高的比表面积以及特殊的磁分离物质使其在核酸分离方面具有非常广阔的前景[4]。理论上讲，磁珠粒径越小, 在溶液中悬浮性好，能够保证DNA 与磁珠有充足的结合时间[5]；比表面积较
万方数据
大, 具有较大的吸附容量，有利于应用于微量检材DNA 的提取；在磁珠实际生产过程中，粒径越小生产越困难，需要具有较强的外磁场响应能力，才能磁分离。虽然5um 磁珠260/280比值偏低，但并没有影响后面的PCR 及STR 分型。在吸附过程中磁珠的加入量也非常重要，磁珠加入量过少则不能充分吸附样本中DNA, 过多时虽然能尽可能多的吸附DNA, 同时也会吸附一定量的杂质影响DNA 纯度。以5um 粒径磁珠为吸附材料筛选一个最佳的磁珠加入量, 从图1中得出当磁珠加入量小于40μL ，DNA 浓度随着加入量的增加呈正比增长，大于40μL 以后DNA 浓度增长平缓，因此40μL 为本实验的最佳加入量。DNA 溶于水但不溶于有机溶剂，异丙醇和酒精都是有机溶剂，异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸[6], 但是易使盐类与DNA 共沉淀且在DNA 沉淀过程中异丙醇难以挥发除去，这些都将影响后续实验的进行。实验室常用乙醇沉淀DNA, 乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA 很安全，对盐类沉淀少，DNA 沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验，因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液是DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使DNA 失水而易于聚合。虽然DNA 不溶于乙醇，但一些有机物杂质却能溶于乙醇如某些糖类蛋白质[7]。在DNA 提取过程中会残留很多盐离子垃圾，DNA 中就含有较多的盐离子, 这势必会影响下一步实验的进行，而洗涤液Ⅱ可以有效的洗去一些盐离子杂质。本次研究将通过实验选取洗涤液Ⅱ与无水乙醇的最佳配比3:7，既能有效洗去杂质又能保护DNA 不被洗去。
本研究通过实验对比，对法医学DNA 提取试剂盒进一步优化，在大量实验的基础上，设计系统的操作参数优化方案，完成了从生物磁珠粒径的筛选、磁珠加入量的定量优化以及洗涤液Ⅱ与乙醇比例的各项优化工作，实现了全部操作参数的优化，有效解决了影响试剂性能的多种问题。使得DNA 提取纯化系统能够实现简单、快速、高效的DNA 纯化，有效提高法医DNA 纯化试剂盒的产量，提高获得STR 分型的成功率。用优化后的DNA 提取试剂盒提取陈旧棉签血样和唾液DNA, 经试剂盒扩增，均获得完整的数据分型结果。由图4~8可见，5例样品获得的 STR电泳图谱基线干净，19个STR 基因座除个别大片段基因座外，各基因座等位基因荧光信号分布均衡性较好，可以满足分型要求。本研究使用自主研制的法医DNA 提取纯化试剂盒，
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• 技术与应用•
亲权指数和个体识别似然比计算软件的开发与应用
张 倩1,2，鲁朝霞1,2，李 潇1,2，段文元1,2，克丙申1,2
(1.济南银丰医学检验所，山东 济南 250102；2. 山东银丰司法鉴定所，山东 济南 250013)
【摘要】目的 建立计算亲子鉴定亲权指数（PI ）和个体识别似然比（LR ）的计算软件。方法 依据相关行业规范和文献中给出的计算方法，利用计算机语言Visual Basic 6.0编写程序。结果 开发出适用于PI 和LR 的计算软件。结论 该计算软件可以帮助工作人员提高计算效率，服务法医物证工作。
【关键词】法医物证学；计算软件；Visual Basic 6.0；亲权指数；似然比
【中图分类号】DF795.1 【文献标识码】B 【文章编号】1001-5728（2016）06-0598-03doi: 10.13618/j.issn.1001-5728.2016.06.017
Development and application of a calculation software for paternity index (PI) in parentage testing and likelihood
1,21,21,21,21,2
ratio (LR) in individual recognition /(Zhang Qian, Lu Zhaoxia, Li Xiao, Duan Wenyuan, Ke Bingshen/ 1.Jinan
Yinfeng Medical Laboratory, Jinan 250100, China ; 2. Shandong Yinfeng judicial authentication, Jinan 250013, China )
【Abstract 】 Objective To establish a calculation software to determine paternity index(PI) in parentage testing and likelihood ratio (LR) in individual recognition．Methods Based on relevant industry standards and literature, using Visual Basic 6.0 to write the program．Results We successfully developed the calculation software for paternity index (PI) in parentage testing and likelihood ratio (LR) in individual recognition．Conclusion The calculation software can help staff to improve the calculation efficiency, and serve the forensic evidence．
【Keywords 】forensic biological evidence; calculation software; Visual Basic 6.0; paternity index; likelihood ratio
【作者简介】张倩，女，助理工程师，学士，主要从事法医物证鉴定和HLA 分型方面的研究工作。E-mail:[email protected]
在亲子鉴定中，亲权指数（PI ）是判断亲子关系所需的两个概率的似然比。由于其不受父权前概率的影响，故PI 是更为客观的评价遗传学证据价值的指标，
参 考 文 献
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（收稿日期：2015-11-16）
通过优化试验条件，可获得与进口试剂盒同样的
DNA 提取效果，却大大降低了DNA 样本的提取成本，对大幅度提高微量检材提取效率、促进我国DNA 技术的发展有着重要意义。
本研究所采用的国产DNA 提取纯化试剂盒在研制阶段已经过大量验证，故本文所涉及实验未采用大量样本来再次验证，只进行小样本实验来评价优化后的效果。此外，该试剂盒在使用体验方面与进口试剂盒也略有差异，如结合过程中磁珠悬浮时间比M48长，M48磁珠混匀之后90s 后磁珠就已沉到EP 管底部，而法医DNA 提取纯化试剂盒磁珠可以保持悬浮状态5min ，悬浮时间长有利于DNA 与磁珠更好的结合，另外磁珠干燥过程中该试剂盒在65℃烘3min 即可干燥，而M48需烘6min 。但峰高略低则说明该试剂盒提取的DNA 中含有对扩增过程抑制成分，在下一步研究中还有待改进。
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