普通光学显微镜的使用及革兰氏染色法
摘要:微生物的最显著特征就是个体微小,一般必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法,可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本实验只要是学习并掌握油镜的使用及革兰氏染色的方法和步骤,巩固平板划线分离法及无菌操作技术。 关键词:显微镜 油镜 革兰氏染色法
1前言
1.1实验目的
1. 学习并掌握普通光学显微镜及油镜的原理和使用方法。 2. 掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能,了解球菌、杆菌等在光学显微镜下的基本形态特征。
3. 学习细菌染色的原理和方法。
4. 掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 5. 巩固平板划线分离法及无菌操作技术。
1.2 实验原理
1.2.1 显微镜的使用
在普通显微镜(图1)通常配置的几种物镜中,油镜的放大倍数最大,对微生物研究最为重要,与其它物镜相比,油镜的使用方法比较特殊,需要在载玻片和物镜间加滴镜油(通常用香柏油),这主要有以下两方面的原因:①增加照明亮度 从承载标本的玻片透过来的光线,因介质密度不同,有些光线会因折射或全反射不能进入镜头,致使摄入光线较少,物象显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失,在使用油镜时必须在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率(n=1.55)相仿的镜油(通常用香柏油,其折射率n=1.52)。光线通过载玻片可直接通过香柏油进入物镜而几乎不发生折射(接物镜油浸系),使视野增加进光量,这样就能使物像更加清晰。详见图2 ②增加显微镜的分辨率
图1 图2 1.2.2 革兰氏染色法
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram 所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类,是细菌
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学上最常用的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮) 脱色,最后用复染剂(如番红) 复染。经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色) ,该菌属于革兰氏阴性菌。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌,是由这两类菌的细胞壁结构和组成的差异所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色
2材料与方法
2.1 材料
2.1.1菌种
大肠杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物,金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物,枯草杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 2.1.2溶液和试剂
香柏油,二甲苯,革兰氏染液,草酸铵结晶紫染液,卢戈式碘液,95%乙醇,番红复染液等。 2.1.3仪器和其他用品
酒精灯,载玻片,普通光学显微镜,擦镜纸,接种环,试管架,镊子,载玻片夹子,载玻片支架,滤纸,滴管和无菌生理盐水等。
2.2方法与步骤
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2.2.2显微镜的操作步骤
2.2.3 革兰氏染色实验步骤
3结果与分析
3.1简单染色的实验结果
经简单染色的大肠杆菌呈现紫色,细菌形态为杆状。如图3所示。
3.2革兰氏染色的实验结果(见下表,附图)
革兰氏染色后实验结果
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图3 简单染色后的大肠杆菌 图4 革兰氏染色后的大肠杆菌
图5 革兰氏染色后的金黄色葡萄球菌 图6 革兰氏染色后的枯草杆菌
图7 革兰氏染色后的自选细菌
3.3结果分析
根据革兰氏染色的原理以及观察到的细菌的染色情况可以知道,大肠杆菌被染成红色,
为革兰氏阴性菌;金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌被染成蓝紫色,为革兰氏阳性菌;自选的待测菌种经革兰氏染色后呈现蓝紫色,可知该菌种为革兰氏阳性菌。
3.4思考题
1. 油镜观察时应注意的问题:①在使用油镜之前,必须先经低、高倍镜观察, 然后将需进一步放大的部分移到视野的中心;需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油,在转换油镜时,从侧面水平注视镜头与玻片的距离,使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。②
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油镜使用完毕,先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去,然后再用干擦镜纸擦干净。在载玻片和镜头之间加入香柏油的作用:①增加照明亮度 ②增加显微镜的分辨率。
2. 什么是物镜同焦现象?它在显微镜观察中有什么意义? 在一般情况下,当物像在一种物镜中已清晰聚焦后,转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时,物像将保持基本准焦的状态,这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象,可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦,从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。
3. 影响显微镜分辨率的因素:最小可分辨距离=λ/2nsinθ(λ为光源光波波长,n 为介质折射率,θ为物镜镜口角的半数,即取决于物镜的直径和工作距离)
4. 革兰氏染色成功需注意的问题:①一定要选处于活跃期的菌种染色,老龄的 革兰氏阳性菌会被染成红色造成假阴性。②涂片不宜过厚,以免脱色不完全。③控制好脱色时间,脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性。
5. 当用革兰氏染色法对某些菌染色时,如果这种菌本身能够与结晶紫结合的足够紧密,就可以省去媒染的步骤。如果不需要观察革兰氏阴性菌的形态特征,可省略复染的步骤,此时显微镜下的革兰氏阴性菌无色。
6. 老龄的革兰氏阳性菌会被染成红色造成假阴性,这是因为若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
7. 为什么肺部组织未被染上蓝紫色? 因为肺部组织细胞没有细胞壁,虽然细胞膜也可附着结晶紫燃料,但在脱色是很容易被洗掉,故不能染色。
参考文献
1. 沈萍 陈向东. 微生物实验[M].4版. 高等教育出版社,2007.40-44及81-84页
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