wsm文献综述的方法

看文献的侧重点:

以什么为研究对象?

研究了什么内容?

为什么作者要选用此研究对象?选择此研究内容?提出了什么样的假设? 用什么方法?

材料与方法的阐述、描述、叙述方式?

结果总结的方式

结果呈现的方式

有何结果?

结果是否说明了作者的假说?结果说明了什么问题?

作者围绕什么问题展开讨论的?

――本论文结果验证了什么假说?发现了什么新的现象?发现了什么新的问题?

本研究所采用的方法的科学性是否存在问题?需要进一步改进的地方?

结果的科学性如何?是否有偏差?

本次研究回答了什么样的科学问题?进一步的研究工作的展望。

总结文献的常用句式:

+++(2005)以+++为对象,采用+++方法(手段、技术),研究了该种(类)植物准噶尔盆地种群的遗传结构、+++(等各类内容),发现+++(等结果)…….

有研究者报道了+++植物种群的遗传结构,发现…..(客观结果),说明…..(科学问题)(+++,2005)。

+++等(2005)在研究+++种群遗传结构时,采用了+++方法,得出了……..的结论。

最后,通过文献综述,得出总结:

我所要研究的对象与内容有哪些方面有人做了研究?我要开展的方面是否有人在研究,我的研究与其它人的区别在那里?(创新性)

我所要采用的方法(手段、技术)是否在此类(对象、内容)研究中有应用?预期应用此方法可以解决哪些问题?

例:

注意文中作者对别人的研究进行的评论性总结!并由此引出自己的观点与看法。

最后落实到阐述自己的研究内容的科学性意义上。

植物种群作为个体和生态系统得一个重要环节近来越来越受到科学工作者得重视在种群生态学研究的基础上利用现有资料借助计算机手段,皮洛(1986)模拟种群动态预测某一种群按现有规模存活一定时间如100年的概率或给出某一种群存活一定时间所必须的最小种群数量,即种群生存力的分析。PVA方法已经成功地对至少35个物种进行了生存评估和分析证明对于濒危的生存分析是一个行之有效的方法(王伯荪1995) 。

种群生态学在回答生存繁殖及基因流中的变异如何改变种群内与种群间的等位基因频率交配迁移和杂交等事件以及在种群对特殊生境的适应过程中的意义确定种群适合度及其与种群间的趋异程度的生态关系等问题时都要求利用能独立分离的遗传标记。Allendorf,1960年代开始利用等位酶作遗传标记取得了巨大成就。但由于等位酶缺乏足够的变异,当需要掌握种群内个体更多的遗传关系的信息回答生态学中宏观上许多难以解决的问题时,显得不太适用。

这时生态学家把目光投向了基于DNA的遗传标记技术,目前许多新的分子标记技术迅速发展,同时遗传数据的统计方法及应用软件(Clegg,1984; Hamrick,1991)也相应发展起来并结合到生态学研究中,取得了巨大成就。

分子标记技术在种群生态学上的应用方兴未艾,植物种群研究应用分子技术手段已有近30年的历史,始于蛋白质同工酶研究。

Allard(1975)首次将这项技术应用于植物种群研究的,他们早期研究的对象是大量的野生植物种群和作物主要是用等位酶分析测定了植物交配系统中近交和远交的比率,并揭示了基因组非随机结构。

我国有关植物种群分子标记研究的工作始于70年代末到80年代初,已对红松(杨一平1991)银杉(谢宗强,1995;1995;1994;1999; 祁承强,1988;),马尾松,(葛颂1987、1988),辽东栎、蒙古栎、水青冈(李俊清,1996),长白松、红皮云杉和鱼鳞云杉(胡志昂等1983、1984、1986,李俊清1998)等物种应用同工酶、随机扩增多态DNA(RAPD)等方法分析了种群的遗传结构与变化。

而发展到今天多种分子标记方法均被引入植物种群研究中诸如对种群的遗传结构与分化种群交配系统与杂交种群遗传多样性与濒危种群的保护生物学生境破坏对种群遗传结构的影响以及遗传修饰生物体的生态效应等。胡新生(1999)、胡志昂(20010的研究都是在分子生物学技术的研究基础上对植物种群生态学研究的发展.本文对用于植物种群分子生态研究中的主要方法其以往研究的情况概述如下。

(要对别人的研究进行评论性总结!)

1.3 植物种群研究中的分子标记及其应用

种群population可以定义为同一物种占有一定空间和一定时间的个体的集合体或者说在一定空间里的某个种的一群个体就是种群种群的基本构成成分是具有潜在互配能力的个体种群是物种具体的存在单位繁殖单位和进化单位种群是一个具有自己独立的特征结构和机能的整体一个物种通常可以包括许多种群不同种群之间存在着明显的地理隔离,长期隔离的结果有可能发展为不同的亚种甚至产生新的物种。

植物种群作为个体和生态系统得一个重要环节近来越来越受到科学工作者得重视在种群生态学研究的基础上利用现有资料借助计算机手段,皮洛(1986)模拟种群动态预测某一种群按现有规模存活一定时间如100年的概率或给出某一种群存活一定时间所必须的最小种群数量,即种群生存力的分析。PVA方法已经成功地对至少35个物种进行了生存评估和分析证明对于濒危的生存分析是一个行之有效的方法(王伯荪1995) 。种群生态学在回答生存繁殖及基因流中的变异如何改变种群内与种群间的等位基因频率交配迁移和杂交等事件以及在种群对特殊生境的适应过程中的意义确定种群适合度及其与种群间的趋异程度的生态关系等问题时都要求利用能独立分离的遗传标记。Allendorf,1960年代开始利用等位酶作遗传标记取得了巨大成就。但由于等位酶缺乏足够的变异,当需要掌握种群内个体更多的遗传关系的信息回答生态学中宏观上许多难以解决的问题时,显得不太适用。这时生态学家把目光投向了基于DNA的遗传标记技术,目前许多新的分子标记技术迅速发展,同时遗传数据的统计方法及应用软件(Clegg,1984; Hamrick,1991)也相应发展起来并结合到生态学研究中,取得了巨大成就。分子标记技术在种群生态学上的应用方兴未艾,植物种群研究应用分子技术手段已有近30年的历史,始于蛋白质同工酶研究。Allard(1975)首次将这项技术应用于植物种群研究的,他们早期研究的对象是大量的野生植物种群和作物主要是用等位酶分析测定了植物交配系统中近交和远交的比率,并揭示了基因组非随机结构。我国有关植物种群分子标记研究的工作始于70年代末到80年代初,已对红松(杨一平1991)银杉(谢宗强,1995;1995;1994;1999; 祁承强,1988;),马尾松,(葛颂1987、1988),辽东栎、蒙古栎、水青冈(李俊清,1996),长白松、红皮云杉和鱼鳞云杉(胡志昂等1983、1984、1986,李俊清1998)等物种应用同工酶、随机扩增多态DNA(RAPD)等方法分析了种群的遗传结构与变化。而发展到今天多种分子标记方法均被引入植物种群研究中诸如对种群的遗传结构与分化种群交配系统与杂交种群遗传多样性与濒危种群的保护生物学生境破坏对种群遗传结构的影响以及遗传修饰生物体的生态效应等。胡新生(1999)、胡志昂(20010的研究都是在分子生物学技术的研究基础上对植物种群生态学研究的发展.本文对用于植物种群分子生态研究中的主要方法其以往研究的情况概述如下

1.3.1植物种群分子生态学研究中的分子标记

1.3.1.1 等位酶(allozyme)

等位酶分析是根据生物体内由单一位点的不同等位基因产生的具有生理功能相同而结构不同的一类酶,通过电泳分离组织染色方法来反映不同位点的等位基因变化情况,在过去20-30年种群学研究中已广为应用。对于种群学研究,等位酶的分析相对于其它分子标记方法来说比较简单,而且可一次测定大量个体的多个特征特别是采用淀粉凝胶,可用一块胶剖成多层进行不同种类等位酶染色(王中仁,1998; Soltis,1983)。等位酶的分析不需要DNA分析那么多的时间和费用,等位酶对种群研究其优点为共显性即能反映每个位点各等位基因的情况,分析方法较DNA简单,它能在种群内种群间发生变化而反映大量生态渐变群(Cline) (Bachmann,1994)和种群水平上的遗传结构和变化(Hamrick,1990; Nevo,1984;)。如在植物种群遗传结构(Brown,1981; Sruck,1994; Qian,1995; Lovless,1984)、种群内遗传多样性(Dswson,1993)、种群的交配系统(Hamrick,1979; Soltis,1990)、亲本分析和基因流(Hamrick,1987)、种群间的遗传分化与相关程度(Hamrick,1979; Hamrick,1991; Merrell,1981;

Nevo,1984;)等方面。等位酶在种上的应用,还有系统学和进化研究,结合形态、化石、细胞及DNA分子等的分析来建立系统树。.特别是对于小进化即亲缘关系近的类群(Chen,1998; Murphy,1993),如杂种起源(Yel,1986)物种形成,以及进化的速率和时间(Hizume,1988)等。 尽管等位酶的表现型与基因型有较好的关联(Crawford,1983),但等位酶只反映了一部分功能基因(外显子)的情况,而对大部分功能基因和大量非功能基因无法表现,使其应用范围有一定局限性(Powell,1994)。从统计的可靠性来说,应该有10-20种等位酶的数据,但有些种群大多数等位酶位点常为单态(Parker,1998),这样对分布狭窄或经过瓶颈效应的一些种群就很少发现多态现象,甚至对一些大范围分布的种群(Mashburn,1978)也是这样。而且等位酶一方面由于是功能基因的产物,而功能基因相对比较保守,由功能基因控制的等位酶常常难以反映生态作用的变化。而另一些酶如过氧化物酶类等(Johnson,1997),对环境变化的敏感性高但却常是基因调控的结果(多基因作用),其机理不清因此等位酶在涉及种群因生态作用而发生的更细微的变化上仍有一定的局限性。

1.3.1.2 DNA标记

高等植物的基因组DNA标记的最大优点是它直接提供了遗传物质的信息而不是象等位酶那样是转录或翻译的产物(Nienhuis,1987)。

DNA分析直接反映种群的基因型,即是表现型又是基因型。作为生态学分析的分子标记要求对生态因子变化敏感,从理论上讲,潜在的DNA标记几乎是无限的,并且作为探测变异的方法,DNA分析要比同功酶分析有效得多(Clegg,1984) 。

对于诸如进化等研究的理想遗传标记应是非编码的DNA分子,这是因为这些片段比暴露在选择作用下的编码基因产物(如等位酶等)要好。

但作为种群生态研究编码基因(产物)的变化仍是反映环境作用的重要组成部分,DNA分子不同的区域有不同的核苷酸取代率(Li,1985),DNA的高变化区域有时能提供区别每一个体唯一的指纹。

特别是对种群学研究来说,以DNA指纹来探测核DNA的多样性,用异源的探针检测DNA的高变化区是一重要的发展方向(Schaal,1991)。

DNA分析的优点还在于较易采集和保存。

有些DNA分子甚至可保存上亿年(Cano,1993,通常只需少量的DNA(ng水平)通过PCR扩增后即可进行分析。

植物DNA包括核DNA(nuclear DNAnDNA)、叶绿体DNA(chloroplast DNA, cpDNA)和线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)。

核DNA是通过双亲遗传的并依孟德尔遗传,这种特性可用于母性家系奠基者效应(founder effect)杂交和遗传渐渗(Wendel,1989)(intergression)等研究。

目前用于植物种群学研究的DNA标记,有很多对于核DNA可以用任意引物也可用特定引物技术。

任意引物(arbitrary primers)技术包括RAPD、AP-PCR、DAF、AFLP等,此类方法不需要预先知道目的基因的序列数据,引物一般为随机合成的寡核苷酸单链。也有用已知的引物序列,AFLP就是用已知序列的引物去检测基因组的组成和变化(Vos,1995)。

特定引物(specific primers)技术包括RFLP、SSR、DNA测序等,这类技术必须知道所扩增目的基因的引物序列。

1) RAPD法 随机扩增多态DNA(random amplified polymorphic DNARAPD)是用一组随机合成的长810bp的寡核苷酸作为引物直接通过与基因组DNA上相应的互补序列结合再通过PCR扩增这些随机片段电泳分离染色后再分析多态性由于该方法灵敏度较高在条件控制得当的情况下RAPD对解决一些种下亲缘关系相近的分类单位(taxon)是有效的

(Lerceteau,1998; Wachira, 1995)也可用在种群遗传变异研究中(Gillies,1997; Lynch,1994; Schierenbeck,1997; Szmid,1996;)此外根据所用引物的长短不同还有DAF(DNA amplification fingerprinting DNA扩增指纹)和AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction 任意引物PCR)前者所用引物短58bp扩增产物片断多后者所用的引物较长常有2030bp扩增片断少专一性强

2) AFLP法 扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphismAFLP或 selective restriction fragment amplification 选择限制性片段扩增(Zabeau,1993;)这是在RFLP和PCR的基础上发展出来的一种有效的用于种群研究的方法(Wang,1999; Chen,1998; Beismann,1997)它的特点是通过合适的限制性内切酶消化再接上人工合成的双链接头作为PCR扩增的模板扩增后再聚丙稀酰胺凝胶电泳分离银染化学荧光法或放射自显影等方法观察其引物由3部分组成与接头互补的核心序列内切酶识别位点和3端的选择碱基与RAPD相比AFLP由于用限制性内切酶消化完全在其他条件恒定时重复性好与特定引物技术中的分子标记如SSRRFLPDNA测序等比较AFLP是不需知道基因组DNA的情况就可检测种群的遗传变化情况这正好能较好符合这些要求因而适合应用于植物和微生物的种群分子遗传研究因为AFLP方法是利用限制性酶切作用于整个基因组DNA其中包含有大量的酶切位点酶切可得到大量相应片段通过各片段的差异反映多样性变化而其它方法只酶切一个或少数位点通过AFLP获得大量的分子变异信息显示以AFLP为手段分析种群生态学上的差异也有较好地体现(Arcade,1999;Wang,1999)并能反映种群较范围的生态变异一次可分析大量位点这对于小种群或小样本的遗传分析统计也有利(Nei,1987)因而在植物种群学研究中有其优越性还可作为杂种鉴定(Chen,1998)与种群的数量性状特征(QTL)的检测手段(Lerceteau,1998)以及通过AFLP特殊片段的进一步探测来揭示种群与生态环境的分子作用机理因而AFLP将在植物种群学研究的更宽广领域内应用

3) RFLp法RFLP (restriction fragment length polymorphism限制性片段长度多态性)是利用限制性内切酶对专一位点进行酶切再通过克隆技术扩增由于同一种群或不同种群中个体间或个体内两组基因序列有限制性酶切片段长短或位点的重复缺失造成的变化经电泳分离后这些DNA片断就会在琼胶板上分开.这些DNA分子从琼脂胶被转移到尼龙或纤维素薄膜上后再用DNA分子探针进行杂交放射性自显影后将其上相对应的片段做电泳分离及进行多态性分析植物种群学和植物系统学中用此方法有很多例子(Miller,1990)其特点是有共显性灵敏度较高可重复性强但可选择的内切酶实际上有限而且操作时间长需载体有放射性等是其缺点

4) SSR(微卫星)法 微卫星-DNA(microsatellite-DNA),又叫单序列重复(single sequence repeat,SSR)或短串联重复(short tandem repeat,STR)微卫星是指整个真核基因组中普遍存在的排列25核苷酸的短串联重复单位.在真核基因组中微卫星很丰富通常长度能达到单位在真核基因组中微卫星很丰富通常长度能达到150bp统计分析测出人类微卫星的平均突变率是0.1%不同物种的微卫星在突变率上有同样的稳定性(Arcade,1999;Russell,1997)SSR的PCR引物设计为对一个高变重复位点是专一的用引物扩增相应的这段微卫星后再通过电泳分离变化可经溴化乙锭染色或银染后观察一个一般种群常可显示超过10种类型的等位基因该方法的主要缺点首先是要花时间了解高变区的序列去设计引物动物体内的SSR一般CA/GT][n] 的重复较多而植物体内GA/CT][n] 和AT/TA][n] 的重复较多为了避开引物互补等造成的偏差故不用AT/TA][n] 的重复片段引物对Quercus 属的几个种群已有SSR的研究(Dow,1996; Isagi,1997)随着该方法在不同的分类单位上的应用为根据不同的分类单位设计引物提供了基础也可参考相近亲缘种来设计引物微卫星与等位酶相似具有独立的共显性等位基因而由于微卫星是中性的且比等位酶法有更多的可检测等位基因这种方法将提供更细致的基因变化分析范围该方法在种群研究上表现了很大的潜力对于种群生态学研究有重要意义因此微卫

星被认为是第二代种群研究分子标记

5) DNA测序(DNA sequencing) 这种方法在解决种群学和系统学问题中都是可靠的它可以避免等位酶在电泳过程中由于相似的迁移率和相同的遗传密码而无法检测到信息的情况但通过DNA测序分析观察到的单基因多态性只揭示该单基因的进化史(Nei,1987)或变化情况在种群学研究中如果针对某些特征的适应基因鉴别和测序特别基因对这种特征的描述是有用的而对一般的种群学研究需要对许多基因进行测序而且由于需要耗费极多的时间和费用所以DNA测序在种群学研究中的可行性需要认真考虑

1.3.2 植物种群学中分子标记应用的比较

现代分子生物技术中可以用于种群学的方法很多,对不同研究目的采用不同方法。对植物基因组DNA鉴别来说,不同的分类层次上,所选用的探针不同,如AFLP、RAPD、SSR、RFLP、DAF等可用于种群及个体水平的研究。这些DNA分子标记甚至可提供象人指纹般的个体分辨能力,而ITS18s rDNA等的DNA序列分析,更适用于物种水平以上类群之间差异的研究,这是由于这些序列片段相对保守,在个体间很少发生变化。而这些不同的测定位点和分子标记的选取其间的界线又很难划定,所以要根据具体的研究对象及研究目的来决定。同时也要考虑到分析DNA片段或PCR扩增产物的流程,并进行效率和费用等的比较策略。

目前种群生态学研究中所涉及的分子标记有等位酶RFLPRAPDVNTR (variable number tandem repeats 变化数目串联重复其中包括小卫星(minisatellite)和卫星微AFLP以及DNA测序等方法选用不同的分子标记对解决种群生态学中不同的问题是十分重要的作为植物种群生态学中不同的问题是十分重要的作为植物种群学中分子技术所用各种不同的分子标记根据研究者所想解决的问题选用合适的分子标记每一种标记所提供的信息的质和量都是不同

的DNA分子在基因组不同的部位表现不同的变化速率(Luo,1985)值得强调的是并非采所用分子标记方法越新越难就越好而要根据所要解决的问题来定对于种群水平的研究一方面需要了解其中的多样性水平及其种群间的相互关系灵敏的分子标记就能提供更多的信息但除了灵敏度高之外所获得的信息要重复性好稳定可靠可比性高同时利用于种群的遗传结构等位基因频率以及种群间的遗传分化研究等并要求便于统计分析比较适合这类分析的分子标记有等位酶RFLP以及微卫星Russell等(1997)比较了几种分子生物学方法(RFLPAFLPRAPDSSR)在检18个大麦品系种群遗传变化水平中的情况指明所有这些方法都能鉴别每一个品系不同之处在于反映出的多态性水平不同随着分子生态学的迅速发展分子生态学的研究方法也会越为越多越来越完善现将种群生态学研究中采用的主要几种方法比较如下表3

1.4.2具体研究内容

本文试图通过太白红杉生物多样性的研究,从宏观生态学和微观分子生态学两个层面分析太白红杉与生境间的相互关系及其太白红杉种群数量动态规律和群落学过程预测太白红杉的遗传学命运和生存潜能揭示太白红杉的变异规律和分化机制探索太白红杉的致濒原因具体内容包括 种群多样性的研究---从太白红杉种群的年龄结构存活曲线死亡龄级分布生命表生态位破碎环境等方面进行深入的研究揭示其种群生态学的一般规律 群落多样性的研究1群落种类组成的区系分析确定占优势的区系成分2群落外貌分析建立太白红杉群落的生活型谱同时对该群落的季相变化进行分析3群落结构分析从垂直结构和水平结构两个方面分析其生态学规律4群落中物种多样性的研究 遗传多样性的研究研究太白红杉种群内种群间分子的遗传变异和分化以及这些分子变异与其生境或生态学之间的联系


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