土壤放线菌分离方法的初步研究
摘要：为了提高从土壤中分离放线菌的效率，解决土壤中的细菌对放线菌分离培养中的污染问题，研究了自然风干、重铬酸钾、青霉素和干热处理4种方法对细菌及放线菌的作用，并对其细菌和放线菌菌落数进行统计。结果表明: 土样放置6 d和21d适合放线菌的分离；用加50 mg/L的重铬酸钾或1 mg/L的青霉素的培养基，可以选择性地从土壤中分离放线菌；土样在80℃下干热处理也可提高放线菌的分离效率。
关键词：土壤放线菌；分离；风干时间；重铬酸钾；青霉素；干热处理
Preliminary Studies on the Isolation Methods of Actinomycetes from Soil Abstract：In order to improve the efficiency of isolating actionmycetes from soil and solve the problem of contamination by bacteria when actionmycetes were isolated and cultivated, the effect of natural air-dry time, potassium dichromate(K2Cr2O7), penicillin and heat treatment of fabrics on bacteria and actionmycetes was studied in this article, and the number of bacteria and actinomycetes colonies separated f rom soil samples.The result showed tha:6 or 21 days of air-dry is optimal for actionmycetes separation from soil sample; The numder of actionmycetes can be selectively isolated by using a special medium contanting 50 mg/L potassium dichromate or 1 mg/L penicillin; Treating the soil samples with at 80℃ can also promote the efficiency of isolating actinomycetes. Keywords: soilactinomyeetes; isolation; air-drytime; potassiumdichromate(K2Cr2O7); penicillin;heat treatment of fabrics
引言
土壤放线菌是具有巨大应用价值的微生物类群。自Wakksman和Umezwa发现放线菌用途的多样性后，人们还发现放线菌可作为抗生索、维生素、酶和酶抑制剂的产生菌[1]。迄今为止，微生物产生的2万多种生物活性物质(如抗生素等)，有近60％～80％是放线菌产生的。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。从放线菌中筛选新抗生素已成为目前研究的重要课题之一。放线菌大量存在于土壤中,从土壤中分离、纯化、快速筛选目标放线菌是抗生素开发、应用的基础。对于刚采集的土壤样品,细菌和真菌的含量多而放线菌又长势缓慢,不利于放线菌的分离[2]。所以，应尽可能从土壤中分离出放线菌，排除其他微生物如细菌的干扰，创造有利于放线菌生长的条件[3]。为此，笔者就如何抑制土壤其它杂菌的污染
和如何选择抑制剂进行了初步研究，以寻求既能抑制细菌生长，同时又不影响放线菌生长的分离方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1土壤样品 2010年7～9月采集于河南农业大学小花园10～20cm深层土[4]，混合，过筛。
1.1.2供试药品与试剂 重铬酸钾、青霉素、可溶性淀粉、琼脂、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·4H2O。
1.1.3 仪器 全自动蒸汽灭菌器(日本AL P ,CL-32L) ；电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司,DHG-9240A)；超净工作台(苏州净化设备有限公司, SW-CJ- 2FD)；智能生化培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂,SP-150)；托盘电子分析天平(岛津国际贸易有限公司,A Y-220) 。
1.1.4培养基（高氏一号合成培养基）
可溶性淀粉20g/L、KNO3 1g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCL0.5g/L、10% FeSO4·4H2O溶液2滴、琼脂15~20g。用少量蒸馏水将淀粉溶解并加热至60~70℃使淀粉呈透明状，然后倒入煮沸的培养基中，调pH 至7.4～7.6[5]。
1.2方法 采用稀释平板法:将土样制成10-2、10-3、10-4 、10-5 的土壤稀释液。分别取10-2、10-3、10-4 、10-5的土壤稀释液0.2 mL加入已做好的培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释液均匀地涂布整个平板，放入28 ℃恒温培养箱中培养，每个浓度设2个重复，对照为不作任何处理的土壤样品[2]。
2 结果与分析
2.1 土样自然风干对放线菌计数的影响
土样一般都要放置一定时间，再做分离，这样可以减少耗费、提高放线菌检出的效率[2]。按照上述放线菌的分离与纯化的方法做土样放置第0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d的重复试验,统计出各时间段土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。
在高氏一号培养基上，采用稀释平板法分离土壤样品,观察各类微生物出现的情
况:10-2稀释度平板上分离到的菌株多,但生长密集或连成片的较多，挑菌有些困难；10-3稀释度的土壤稀释液放线菌分离效果好,平板上的菌落数适中，细菌生长密集；10-4稀释度的土壤稀释液细菌分离效果好,平板上的菌落数适中；10-5稀释液平板上很少甚至没有。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计，结果见表1。
表1 土样放置不同时间对微生物菌落数的影响
细菌（10-4）
放线菌（10-3） 340 32 88 97 171 23 53 75 151 56 212 60 139 57 91 127 54 31 114 27 从放置0d的新鲜土样到放置27d的土样统计结果来看，放置0d细菌菌落很多，平板菌落密度过高,相邻菌落相连甚至形成片状菌落,严重影响了放线菌菌种的挑取。放置6d的放线菌菌落较多,种类也较齐全，而细菌数量下降较快。土样放置21d ,培养皿内的细菌非常少,且放线菌种类下降不明显，非常适合放线菌分离。而放置27d的土样,细菌非常少,但是放线菌数量也大量减少，所以不适合放线菌的分离。由此可见,土样放置6d和21d均适合放线菌的分离,但放置6d的放线菌的种类更多更全，而放置21d的放线菌单菌落更突出。
2.2 重铬酸钾对放线菌计数的影响
按照放线菌的分离与纯化的方法，在高氏一号培养基中加入25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L的重铬酸钾，统计出土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计,结果见表2。
表2 重铬酸钾对微生物菌落数的影响
从土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数的统计结果来看，无论是任何含量的重铬酸钾,细菌、放线菌菌落数基本呈逐渐减少状。在含25mg/L重铬酸钾的平板上放线菌菌落较多，但细菌菌落也很多,平板菌落密度过高,影响了放线菌菌种的挑
取；在含50 mg/L重铬酸钾的平板上，细菌菌落大幅度减少，放线菌菌落较多,种类也较齐全；在含75mg/L、100mg/L、125mg/L重铬酸钾的平板上，细菌非常少,但是放线菌数量也大量减少甚至没有,所以不适合放线菌的分离。即抑制剂重铬酸钾为50 mg/L时最适合放线菌的分离。
2.3 青霉素对放线菌计数的影响
同重铬酸钾对放线菌计数的影响，在高氏一号培养基中加入1mg/L、3mg/L、5mg/L、7mg/L、9mg/L的青霉素（160万单位），统计出土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计,结果见表3。
表3 青霉素对微生物菌落数的影响
从表3可以看出，无论是任何含量的青霉素,细菌、放线菌菌落数基本呈逐渐减少状。在含1 mg/L青霉素的平板上，细菌菌落大幅度减少，放线菌菌落较多,种类也较齐全；在含3mg/L、5mg/L、7mg/L、9mg/L的青霉素的平板上，细菌非常少,但是放线菌数量也大量减少，所以不适合放线菌的分离。即抑制剂青霉素为1 mg/L时最适合放线菌的分离。
2.4 土壤样品干热处理对放线菌计数的影响
分别将土样在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃等不同温度下干热处理1h，然后采用稀释平板法分离土壤样品，统计出土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。因干热处理对微生物数量影响较大，所以以10-3稀释度平板上的细菌作统计，10-²稀释度平板上的放线菌作统计,，结果见表4
表4 干热处理对微生物菌落数的影响
从土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数的统计结果来看，干热处理使细菌、放线菌菌落数基本呈逐渐减少状。60℃、70℃时细菌菌落减少不明显，平板菌落密度过高,影响了放线菌菌种的挑取；80℃时细菌菌落大幅度减少，放线菌菌落较多,90℃、100℃、110℃、120℃、130℃时细菌大幅度减少,但是放线菌数量也大量减少，所以不适合放线菌的分离。即在80℃干热处理1h时最适合放线菌的分离。 3 小结与讨论
3.1 讨论
3.1.1 进行适当的土壤预处理是分离放线菌的重要步骤。试验也表明，干热处理或自然风干使土壤含水量较低，细菌菌落少，而放线菌较耐干燥，利于放线菌的分离筛选。试验表明：土样放置6d和21d均适合放线菌的分离,但放置6d的放线菌的种类更多更全,而放置21d的放线菌单菌落更突出。而土样在80℃条件下干热处理1h时也可以较好的进行放线菌的分离[6-9]。
3.1.2 在分离土壤放线菌时，应为放线菌生长提供适宜环境，并且抑制其他菌落生长，即向培养基中加入抗生素和其他抑菌剂。一般使用放线菌酮(50 mg/L)、海松素(50 mg/L)等抑制真菌。但抑制细菌较困难，因为放线菌对一些抗菌素的反应与细菌相近，抑制剂重铬酸钾、青霉素对土壤真菌、细菌都有明显抑制作用，且不影响放线菌的正常生长，因此重铬酸钾、青霉素可作为选择性分离放线菌的抑制剂[10~11]，试验表明，重铬酸钾的适宜浓度为50 mg/L，而青霉素的适宜浓度为1 mg/L。
3.2 小结
通过上述实验结果可知，将土壤样品自然风干6d或21d可选择性的分离出大量放线菌，同时克服细菌等微生物快速大量生长的缺点；在土壤样品中加入50 mg/L的重铬酸钾或1 mg/L的青霉素可有效抑制细菌的生长，使细菌数大大减少，而不怎么影响放线菌的生长，从而可有效的分离出更多的放线菌；80℃恒温条件下干热预处理1h也可使细菌数大为减少，从而可有效的分离出放线菌。因此，放线菌分离方法可以简化为：土样室温自然风干→碾碎过筛取→80℃恒温条件下干热预处理1h→称取1g加9ml无菌水振荡→取lml清液，加入9ml无菌水→依次稀释至10-3、10-4、10-5→选取10-3、10-4、10-5各取0.2mL，分别加有抑制剂的培养基（50 mg/L的重铬酸钾或1 mg/L的青霉素）涂平板→28℃培养3~5天→挑菌。
参考文献：
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