僵蚕抗凝血酶诱导血管内皮细胞释放作用的研究

　　摘要：目的：研究僵蚕抗疑血酶诱导血管内皮细胞释放作用的影响。方法：将不同浓度的僵蚕注射液(600μg/mL，300μg/mL，150μg/mL)加入凝血酶诱导的血管内皮细胞中，培养12 h后收集细胞液，观察不同浓度的僵蚕注射液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放作用的影响。结果僵蚕大、中、小剂量组较凝血酶组均能明显增加组织型纤溶酶原激活物(t－PA)活性，分别为(0.460±0.010)U/mL，(0.457±0.019)U/mL，(0.366±0.014)U/mL(P＜0.01)；同时也可降低纤溶酶原活化素抑制物(PAI)活性，降低血管性假血友病因子(yWF)含量，与凝血酶组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论：僵蚕注射液可以明显抑制凝血酶诱导的内皮细胞释放作用，此作用与僵蚕的抗疑作用有关。 　　关键词：僵蚕注射液；血管内皮细胞；疑血酶 　　中图分类号：R392.5 R289.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)09－0837－03 　　 　　僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕(Bombyx mon，L)4龄～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌[Beauvcna bassiana(Bals)Vaill]而致死的干燥体，为传统中药，又名白僵蚕。早在《神农本草经》中已有记载，味辛、咸，性平，具有祛风定惊、活血通络、化痰散结等功效。应用涉及到心脑血管、肝、肾和血液病等。在对僵蚕抗实验胜静脉血栓及药理作用研究中发现，僵蚕水提液体内外实验均具有较强的抗凝作用。本实验通过比较不同浓度僵蚕注射液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活物(i－PA)、纤溶酶原活化素抑制物(PAI)，血管性假血友病因子(ywF)的影响，阐述僵蚕注射液对凝血酶诱导的内皮细胞释放作用的影响及作用机制。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　材　料 　　1．1．1　脐静脉细胞：新生儿脐带静脉血由湖南中医药大学第一附属医院妇产科提供。 　　1．1．2　药物：僵蚕由湖南中医药大学附一院药剂科提供，制备僵蚕注射液：僵蚕匀浆化小煎，醇沉，制成注射液。pH值7.4，含量相当于2 g/mL。 　　1．1．3　仪器CO2培养箱(美国Format Screntific Co产品)，倒置相差显微镜(中国上海显微镜厂产品)，Multiscan酶标仪(日本Epaan公司产品)。 　　1．1．4　试剂t－PA，PAI，yWF及凝血酶试剂盒均由上海太阳生化公司提供。 　　1．2　实验方法 　　1．2．1　内皮细胞的培养与鉴定：取新生儿脐带静脉，采用0.25％胰蛋白酶消化和机械性刺激获取脐静脉内皮细胞，原代培养。经Ⅷ因子免疫荧光检查并选用生长良好的第2代～第5代内皮细胞用于实验。 　　1．2．2　实验分组：收集对数期细胞，调整细胞浓度接种于96孔培养板中，置37℃、5％CO2培养箱中培养，待培养24 h－48h后培养板内已有80％的细胞呈汇合状态时，加药进行实验。实验分5组：凝血酶(5.0 kU/L)组，僵蚕大剂量组(凝血酶5.0kU/L+僵蚕600μg/mL)，僵蚕中剂量组(凝血酶5.0 kU/L+僵蚕300 μg/mL)；僵蚕小剂量组(凝血酶5.0 kU/L+僵蚕150μg/mL)，以及无凝血酶及僵蚕的空白对照组。每组实验做6个重复孔，培养12 h。 　　1．3　测定指标与方法t－PA，PAI活性测定均用发色底物法，yWF含量测定用酶联免疫吸附双抗体夹心法。严格按试剂盒说明书进行操作，PAI活性用抑制单位每毫升(AU/mL)表示。 　　1．4　统计学处理：计量资料以均数上标准差(X±s)表示，数据处理采用SPSS 12.0统计软件作力差分析和直线回归及t检验，P　　 　　2　结　果 　　 　　2．1　僵蚕对凝血酶诱导血管内皮细胞释放PAI，t－PA，yWF的影响僵蚕大、中、小剂量组均能明显增加t－PA活性，降低PAI活性，降低yWF含量，与凝血酶组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。 　　2．2　僵蚕对凝血酶诱导血管内皮细胞释放反应的影响程度按下列公式计算：影响率=(凝血酶加僵蚕组－凝血酶组)/(凝血酶组空白组)×100％。 　　僵蚕小、中、大剂量组对凝血酶诱导血管内皮细胞释放t－PA的影响率分别为55.1％，95.6％，96.8％，对PAI的影响率分别为29.3％，85.4％和92.5％，对yWF的影响率分别为67.9％，93.1％与94.8％。结果显示，僵蚕大剂量组对凝血酶诱导血管内皮细胞释放t－PA具有明显促进作用，同时对PAl和yWF的释放具有明显抑制作用。 　　 　　3　讨　论 　　 　　近年来研究表明，血栓形成机制与血管内皮细胞、血小板、抗凝、纤溶机制密切相关。凝血酶不但使纤维蛋白原凝固成纤维蛋白，还可以刺激血小板活化释放，诱导血管内皮细胞表达促凝活性，如表达组织因子(TF)、PAI和内皮细胞yWF，并使内皮细胞抗血栓性降低，如t－PA释放，诱导其表面凝血酶调节蛋白下调等。故凝血酶在血栓形成过程中具有多项作用，为其病理过程中的最后枢纽。 　　血管内皮细胞是一个高度活跃的代谢库，它既能合成和释放多种抗栓、溶栓成分，如血栓调节蛋白TM、t－PA、硫酸乙酰肝素等，具有抗血小板聚集、扩张血管和促纤溶作用。又能在受到刺激或损伤时经凝血酶诱导释放多种促血栓形成物质，如凝血因子、内皮素、PAI，且抗血栓性降低，如使t－PA和前列环素(PGI2)释放减少而引起血栓形成，动脉粥样硬化，微循环调节障碍，血流状态改变。因此，维持血管内皮细胞抗栓和促栓功能的平衡对于心脑血管疾病的发生、发展及转归具有重要的意义。 　　yWF具有加速血小板黏附、聚集、介导血小板释放相关因子，干扰纤溶过程，促进血管平滑肌纤维化、动脉粥样斑块及血栓形成，且与疾病的轻重呈芷相关。因此，yWF破认为是心血管疾病的一个高危因素，并被建议作为血管内皮细胞损害的标志物。t－PA与PAI为纤溶系统的重要组成部分，t－PA活性低下或PAI活性增高是血栓形成的一个促进因素。现代药理研究表明僵蚕具有抗凝、抗血栓、促纤溶作用。 　　本研究证明僵蚕可明显提高体外培养凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞培养液中的t－PA活性，降低PAI活性，使纤溶系统的活性增高，同时降低yWF含量，提示僵蚕具确明显的抗凝活性，且呈剂量依赖性，为有效的抗凝药物。据测定结果发现，僵蚕炮制后总蛋白质、氢基酸和草酸铵含量明显增高，分别达24％，14％和32％以上，而其相应的凝血酶时间延长达42％以上，表明这些成分含量越高，其凝血酶时间越长。另有实验结果表明，凝血酶时间与紫外光光度法测定的僵蚕蛋白质含量呈正相关，提示僵蚕的主要活性成分可能是蛋白质和草酸铵。有待进一步深入研究，使其发展成为可供临床使用的抗凝血酶新药。 　　 　　本文编辑　王雅洁