双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用

　　摘要 从双向电泳的历史、原理、操作步骤及其在植物蛋白质组学研究中的应用等几方面进行综合阐述，最后提出双向电泳技术中存在的一些问题，并展望了其在植物蛋白质组学研究中的未来应用前景。　　关键词 蛋白质组学；双向电泳技术；植物　　中图分类号 Q75；Q945.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）20-0013-02　　研究表明遗传信息通过基因携带，但基因结构的相对稳定性、数量的有限性，与生命现象的多变性、复杂性存在明显的差异[1]。为此，研究认为在所有生物体的细胞、组织、细胞器中，各种代谢反应、生理功能的维持均由各组成部分的表面、内部的蛋白质来完成。蛋白质组是Wilkin S等在1994年第1次提出的。1997年蛋白质组的定义被其创造者重申为：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质。”2000年人类基因组序列草图的完成标志着“后基因组时代”的到来。蛋白质组学（proteomics）的概念最终被定义为“一个基因组、或一个细胞、组织在特定的生理和病理条件下表达的所有蛋白质”。蛋白质组具有特殊性和多样性，其研究的三大核心技术分别是双向电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、生物质谱技术和生物信息学[2-3]。其中，2-DE作为蛋白质分离的重要手段，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离上万个蛋白质的方法，且分离纯度可达90%以上。　　1 双向电泳技术的历史　　双向电泳技术自诞生以来，一直在不断的发展、改进。1975年O`Farrell对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究中首次采用了双向电泳技术，称为ISO-DALT（等电点-道尔顿）。其第一向是将载体两性电解质（CA）添加到丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的pH梯度进行等电聚焦；第二向是聚焦后的凝胶在含有SDS的缓冲液中平衡后，用琼脂糖包埋到垂直板SDS凝胶的浓缩胶上，形成不连续的SDS梯度凝胶电泳[4]。这种双向电泳蛋白质由于上样量低，溶解性较差，可能会造成负性部分碱性蛋白丢失。另外，两性电解质在凝胶中扩散相对较容易，形成不够稳定的pH梯度，造成分辨率低，重复性差，此为经典双向电泳技术。　　为克服经典双向电泳技术中出现的问题，Gorg A 等于1985年研究出固相IPG-DALT（pH梯度-道尔顿）系统双向电泳技术，该技术以固相pH梯度为基础，使双向电泳技术有了质的飞跃。固相pH介质是一类丙烯酰胺化合物，与聚丙烯酰胺共价结合后可形成一定范围的pH梯度。与传统的双向电泳相比，IPG-DALT系统双向电泳技术具有上样量大、不产生阴极漂移、重复性较好、pH梯度稳定、分辨率高等优点。目前，IPG-DALT系统双向电泳技术在各国应用广泛。　　荧光双向电泳技术（fluorescent two dimensional differ-ential gel electrophoresis，DIGE）在近年出现，是双向电泳技术的又一次飞跃，是一种对不同样品间蛋白质差异表达进行系统分析的技术。主要用于大样品蛋白质的差异鉴定。　　2 双向电泳技术的原理及步骤　　2.1 双向电泳技术的主要原理　　双向电泳技术是目前蛋白质组研究中最常用的蛋白分离平台，是最高效、最直观的复杂蛋白质组分离技术。它利用各种蛋白质具有不同的分子量、等电点（pI）分离复杂蛋白质组，分辨率、灵敏度较高。其原理为：首先通过电荷分离蛋白质，利用一向等电聚焦将蛋白质沿pH梯度分离至各自等电点；然后沿垂直的方向通过非连续十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量大小差别来达到分离的目的。所得的蛋白双点是基于电荷分离和分子质量大小分离的正交组合，从而分布于整个二维凝胶图谱上，每个点代表其中一个或数个蛋白质，而蛋白质的分子量、等电点在样品中的含量也可显现出来 。　　DIGE的原理是将需要比较的样品在电泳前用不同的荧光染料进行标记，被差异标记蛋白的等电点和相对分子质量基本不受影响，然后将其混合到一块胶内进行分离，并用相应波长来检测不同的荧光标记蛋白，最后用全自动蛋白质表达分析软件进行分析。它的出现有效地提高了双向电泳技术的重复性和定量的准确性。　　2.2 双向电泳技术的主要操作步骤　　双向电泳技术的体系较为复杂，通过多次摸索才能找到适合体系。IPG-DALT双向电泳技术的主要操作步骤如下。　　2.2.1 蛋白质的提取。蛋白质提取的质量直接影响双向电泳试验最终结果，不同植物、不同组织蛋白应采取不同的提取方法。　　2.2.2 蛋白浓度的测定。采用Bradford法测定蛋白质浓度。　　2.2.3 第一向IEF电泳。在进行一向等电聚焦前应将相应的蛋白质与水化液加入样品槽，IPG胶条覆盖在样品上，最后覆上甘油。胶条水化时间应不少于12 h。　　2.2.4 第二向SDS-PAGE。配制相应的凝胶电泳进行二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。注意：等电聚焦电泳结束后应将其放入平衡液Ⅰ中，缓慢震荡15 min。第1次平衡结束后，取出胶条，擦干净背面的液体，然后放入平衡液Ⅱ，缓慢震荡15 min。凝胶应在前一天晚上配，使其充分凝固；压胶条时应避免胶条与凝胶之间产生气泡。　　2.2.5 显色。SDS-PAGE电泳跑完后可用考马斯法或银染法染色。银染法虽然分辨率高，但由于操作方法比较复杂，掌握较困难，且对后续质谱分析等产生影响。考马斯亮蓝法分辨率较低，但操作简单，应用者比较容易掌握，是一种传统的蛋白质染色法。综合考虑，考马斯亮蓝法比较常用。　　3 双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用　　3.1 双向电泳技术在玉米蛋白质组学研究中的应用　　Von Wiren等通过比较铁摄取缺陷型、野生型突变体玉米的蛋白质双向电泳图谱，从中发现4个与铁离子跨膜运输有关的多肽。李冠军等对干旱胁迫下玉米叶片蛋白质经行了双向电泳分析，选出在3个时段下的干旱处理中均有诱导表达的3个差异蛋白点，经过对比分析，3个点的数据库对比结果均达到显著，最后得出结论，玉米可能通过叶组织的木质化，降低水分的散失量，使细胞膨压得到维持，从而提高玉米的耐旱性。王彦玲等[4]利用双向电泳技术对郑单958及其亲本在缺磷条件下进行蛋白质组学分析，得出郑单958可能在磷胁迫的环境适应方面有杂种优势。付忠军等利用双向电泳技术对亲和性转换前后花丝与花粉差异表达蛋白质经行分析，首先摸索到了适合自己的双向电泳体系。最后得到了9个在不同亲和阶段表达差异的蛋白质点。朱畇昊[5]以玉米花粉为材料，建立了相应的玉米花粉双向电泳体系，然后选择成熟的花粉和离体萌发1小时花粉经行双向电泳，得到28个差异显著的蛋白点。 　　3.2 双向电泳技术在水稻、小麦蛋白质组学研究中的应用　　王经源[6]对汕优63及其双亲苗期第3叶蛋白质组进行定量比较，得到1 667个以上的蛋白质点。发现有23个蛋白质点在3个品系间存在显著差异。丁 伟等用双向电泳对水稻叶片全蛋白经行鉴定，发现与干旱等胁迫相关蛋白，且有4个是首次发现。陈卫卫等对耐高温性差异明显的3个品种作为研究材料，经双向电泳分析及质谱鉴定，得出可能为水稻苗期耐高温相关的鉴定蛋白。　　朱 宏等以普通小麦叶片为试验材料，通过优化双向电泳的关键步骤，在小麦叶片可溶性蛋白的分析中获得满意的双向电泳图谱。刘 丽等利用SDS-PAGE、2-DE和MALDI-TOF-MS分析LMW-GS组成，建立了LMW-GS亚基的标准命名系统。孙正娟等以太谷核不育小麦不同时期的幼穗为材料进行双向电泳，得出的结果表明不同时期表达的与育性相关的蛋白不同。　　3.3 其他作物蛋白质组学中双向电泳技术的应用　　Kubis等基于DIGE蛋白质组学，阐明了前蛋白质输入叶绿体的机制。Sybille在分离制备拟南芥叶绿体时，运用荧光差异凝胶电泳分析突变型、野生型植物叶绿体中蛋白的差异性。通过比对多种TOC易位子亚基的野生型和突变性拟南芥的叶绿体蛋白，探究各种易位子复合物对输送蛋白类型的特异性。林金科等研究了茶树芽叶蛋白质提取纯化及双向电泳技术的改进，探索出一种重复性好，清晰度高的蛋白双向电泳技术体系，并发现一种辨别茶树蛋白质样品质量好坏的简便方法。郭春芳等应用差异蛋白质组学方法分析了铁观音茶树幼苗在聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）胁迫下叶片蛋白质组的变化。　　黄华宏等应用双向电泳蛋白质组学对矮化杉木的突变机理进行研究，得到29个差异蛋白质可能与杉木矮化的突变有关。张小静等在深入研究块茎蛋白质发育过程中的差异表达中，建立了马铃薯块茎蛋白质的双向电泳技术体系，并对与其发育相关蛋白质的进行了分析。　　综上所述，双向电泳技术在植物发育过程中蛋白质的数量、组成的检测上应用广泛，可为研究者提供不同发育阶段基因表达和调控的特点。　　4 面临的问题及展望　　双向电泳技术通过研究生物与非生物、植物器官、组织的胁迫蛋白质变化，探讨其病理或生理变化，从而对蛋白质组学的发展研究产生了明显的推动作用。另外，通过与其他蛋白质组技术进行互补、整合，从而进一步拓宽了生命科学研究的途径[7-8]。目前，关于不同条件下植物蛋白表达谱的研究逐渐增加，使大量与逆境、基因发育、突变、植物与微生物互作的新蛋白被发现，但关于这些蛋白质的功能研究目前比较少。因此，在今后一段时间内，植物蛋白质组学的主要研究方向之一为运用生物化学、功能基因组学、生物信息学等方法证实新蛋白质的功能。　　近年来，许多新型技术方法被应用到植物差异蛋白质组学研究中，比如荧光差异双向电泳、同位素亲和标记等。荧光双向电泳技术现已得到应用，并且已经成为商品化，但其价格仍然很高，还不能成为一种普及性的技术。综上所述，通过分析双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用现状，发现植物蛋白质学研究中的主要发展趋势是技术手段的多样化、分析层次的多元化，并与其他学科的紧密融合。　　5 参考文献　　[1] 兰彦，钱小红，王阁，等.蛋白质组分析中蛋白质分步提取方法的建立[J].生物化学与生物物理进展，2001（3）：415-418.　　[2] 贾宇峰，林秋霞，郭尧君，等.蛋白质双向电泳图像分析[J].生物化学与生物物理进展，2001（2）：246-250.　　[3] 张国庆，廖杰，于力方.双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用[J].标记免疫分析与临床，2003（3）：171-173.　　[4] 王彦玲.我国玉米核心种质磷胁迫蛋白质表达差异和基因组SSR分析[D].郑州：郑州大学，2010.　　[5] 朱畇昊.玉米花粉萌发的比较蛋白质组学研究[D].郑州：河南农业大学，2010.　　[6] 王经源.杂交稻苗期杂种优势的比较蛋白质组学研究[D].福州：福建农林大学，2008.　　[7] ZHANG Peng-Yi，LI Yue-Zhong，WU Zhi-Hong.Establishment of Sora-ngium cellulosum So0157-2 Proteome Database Using Optimized Two-dimens-ional Electrophoresis Protocol[J].生物化学与生物物理进化，2012，39（1）：86-94.　　[8] 任丽萍，范海延，宋铁峰，等.基于双向电泳技术的植物差异蛋白质组学研究进展[J].中国农学通报，2011，27（5）：53-57.