动物医学进展,2008,29(2) :982102Progress in Veterinary Medicine
猪传染性胸膜肺炎研究进展
唐文山1, 李 昕23
(1. 青海畜牧兽医职业技术学院, 青海湟源812100;2. 青海省贵南县畜牧兽医站, 青海贵南813100)
摘 要:猪传染性胸膜肺炎(PCP ) 已成为危害各国养猪业的主要传染病之一, 其病原体胸膜肺炎放线杆
菌主要定居在猪的呼吸道, 有较高的宿主特异性。国内外已建立起补体结合试验、酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、间接荧光抗体技术等用于PCP 的检测和流行病学研究。该文就其疫苗的研制、分类、应用等进行概述。 关键词:猪传染性胸膜肺炎; 诊断; 疫苗
中图分类号:S852.6
文献标识码:A
() 0220098205
猪传染性胸膜肺炎(Porcine 2p neumonia , ) 线(Acti ae , 引起的一、性别的猪对本病均易感, 其中以1周龄～4月龄的猪易感性高, 病死率可达5%～30%。在新引进猪群中多呈急性暴发, 发病率和死亡率都在20%以上, 最急性流行死亡率高达80%～100%。自Pattison 等于1957年首次报道后, 欧洲、美国、加拿大、澳大利亚、墨西哥、日本、韩国和中国台湾等国家和地区均有此病发生。我国在20世纪80年代初期, 由于养猪方式大部分以分散饲养为主, 本病发生较少。20世纪90年代开始, 随着集约化养猪业的迅速发展, 加上国家及地区间引种工作的日益频繁, 本病的发病率及死亡率大大高于从前。国内大多数省(区、市) 经病原学、血清学诊断和检疫, 有此病发生的报道。说明PCP 在我国已广泛流行, 并有扩大蔓延之势[1]。早期确诊和接种能控制PCP 的流行[2]。传统的诊断方法和疫苗都存在着不同程度的缺陷, 由于App 血清型较多(共15个血清型) , 不同的血清型之间没有或仅有较弱的交叉保护力, 这就给PCP 的预防和控制带来一定困难。虽然一些药物能有效治疗该病, 如先锋霉素、阿莫西林、头孢噻呋(ceftiof ul ) 、替米考星(ti 2micosin ) 、四环素、氯霉素等。但经常使用药物, 容易使App 产生耐药性, 而且长期用药还会导致药物残留, 使肉品质量下降, 影响人类健康和经济发展。抗生素的治疗虽在临床上能取得一定效果, 但不能消除猪群的带菌状态。
①收稿日期:2007210224
App 属放线杆菌属, 是革兰氏阴性、有荚膜的多
形球杆菌, 有时呈线性, 无鞭毛, 不运动, 不形成芽
孢。在室温下可存活2d ～4d , 4℃存活7d , -25℃可存活2个月。根据培养时是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucle 2otide ,NAD , 又称V 因子) , 可将App 分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型, 生物Ⅰ型为NAD 依赖株, 包括血清型1型～12型和15型, 其中1型又可分为la 和lb 两个亚型,5型又可分为5a 和5b 两个亚型; 生物Ⅱ型的生长不依赖NAD , 但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长, 含有2个血清型, 分别为血清型13和14[324]。App 的血清型是根据表面荚膜(CP ) 和脂多糖(L PS ) 抗原性的不同来划分的, 但有些血清型有相似的细胞结构或相同的L PS 链。这可能是部分血清型, 如血清1、4、10和11型;3、6和8型;4、5和7型等之间存在血清交叉反应的原因[526]。
App 引起猪发病与较多的毒力因子有关, 包括L PS 、外膜蛋白(OMP ) 、转铁结合蛋白(TBP ) 、CP 、溶血外毒素(Ap X ) 、蛋白酶和渗透因子等。OM P 的抗体具有调理活性, 是App 的一种重要保护性抗原, 其参与免疫的主要抗原是分子质量约为42ku 的外膜脂蛋白(OML ) , 它为巴氏杆菌家族所共有; 在宿主体内,Ap X 可以产生一种对肺泡巨噬细胞起毒性作用的物质, 可抑制肺泡巨噬细胞的吞噬活性。同时,Ap X 对外周单核细胞及淋巴细胞也有细胞毒性作用, 被认为是引起感染并使肺组织严重损伤的主要原因[7]。另外,App 的荚膜对巨噬细胞及补体
作者简介:唐文山(1965-) , 男, 青海湟源人, 副教授, 兽医硕士, 主要从事动物传染病预防与防制工作。3通讯作者
唐文山等:猪传染性胸膜肺炎研究进展99
都有抵抗能力, 在白细胞介素21(IL 2l ) 、白细胞介素28(IL 28) 及干扰素(IN F ) 的作用下, 可引起早期的肺组织损伤。因此, 细胞毒素的作用是引起肺组织病变的主要原因。
App 由于荚膜结构、L PS 成分和溶血外毒素类型的不同, 各血清型的毒力不尽相同。J acobsen 等试验证实, 生物Ⅰ型菌的毒力比生物Ⅱ型菌的强, 产生相同病变的最低菌数, 生物Ⅰ型是104cf u/mL , 生物Ⅱ型是109cf u/mL 。一般认为, 生物Ⅰ型中血清1、5、9、10型和11型比其他血清型的毒力强[8]。2 流行病学
速死亡的猪体内, 气管、支气管中充满泡沫状、血性
黏液及黏膜渗出物, 有时可见肺表面有大量的出血和淤血斑。在最急性型的后期, 肺炎区色暗、坚实、切面脆弱。随着病程的延长肺部病灶会逐渐变小, 肺炎区常见大小不同的结节, 这些脓肿样结节被一层厚结缔组织膜包裹, 胸腔内有血液样液体。大部分的慢性病例, 肺都可见胸膜表面被覆有弥漫性纤维素性渗出物。5 诊断5. 1 病原的分离鉴定
App 主要存在于猪鼻腔、气管、肺部组
病猪和带菌猪是本病的传染源。猪与猪之间的
密切接触和排泄污染物是本病传播的主要途径[9]。当App 通过空气传播时, 只有在1m 内的易感猪才能感染。, 转移或混养可增加PCP 和气候剧变北美地区的流行血清型为1、5、7型; 欧洲多为2、3型和9型; 在亚洲, 日本多见2型和5型, 韩国则为2、4、5、7型, 台湾地区主要为1型和5型, 而中国大陆已分离或检测到抗体的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9型和10型[10211]。3 临床症状
最急性型者一个或几个猪群突然发病, 病猪体温升高到41. 5℃, 精神委顿, 食欲明显减退或废绝, 张口呼吸, 呈犬坐姿势。发病后期出现心衰和循环障碍, 耳、鼻、眼及后躯皮肤发绀。晚期出现严重的呼吸困难和体温下降, 病猪临死前从嘴、鼻孔流出血性泡沫样液体。病猪于24h ～36h 内死亡, 死亡率高达80%～100%。急性型:同圈或不同圈猪同时发病, 病猪精神沉郁, 咳嗽, 呼吸困难, 体温升高至40. 5℃～41. 0℃, 初为鼻、耳、腿部皮肤, 继而全身发绀。整个病程稍缓, 通常发病后2d ～4d 死亡, 也可能转为亚急性或慢性。
亚急性或慢性型者通常由急性转化而来, 病猪体温不升高或略有升高, 有不同程度的自发性或间歇性咳嗽, 食欲不振, 精神欠佳, 增重缓慢, 成为危险的带菌者。当受到严重应激或其他病原微生物侵害时(如肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等) , 则临床症状加剧。4 病理变化
织及分泌物中。
, h ～mm 的不透, 。在牛、, 产生β溶血。App 可发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖, 产酸不产气, 个别菌株可发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖; 能使尿酸酶斜面变成粉红色,V P 试验阴性,MR 试验阴性, 硝酸盐还原试验阳性, 产生硫化氢, 不利用柠檬酸盐, CAM P 阳性。App 不发酵碳水化合物, 醋酸铅试验呈阴性反应。5. 2 血清学检测方法
5. 2. 1 补体结合试验 1971年,Nicolet 建立起针
对App 感染的补体结合试验(CF T ) , 由于其特异性高于间接血凝试验(IHA ) [9], 能够将副溶血嗜血杆菌感染与App 感染区分开来, 因此, 很快成为App 分型的标准方法。朱士盛等[4]于1987年用CF T 诊断PCP 获得了满意的效果, 混合抗原与单价抗原的敏感性和特异性比较, 一般前者比后者高1倍。因此, 最佳混合抗原的应用有利于该病的流行病学调查。然而, 与平板凝集、EL ISA 等检测方法相比, 其操作繁琐、费时费力, 一般只在实验室进行。5. 2. 2 凝集试验 凝集试验(agglutination test ,AT ) 中使用的抗血清采自于接种了App 抗原的兔子。如果是22巯基乙醇试管凝集试验, 抗血清用盐水或0. 1mol/L 的22巯基乙醇连续稀释。试管凝集试验需
要反应18h , 而玻片凝集试验的阳性反应通常在2min ～3min 内便可看出结果。此法适用于新分离菌的鉴定和分型, 操作简便, 但无法判定抗体效价[3]。5. 2. 3 间接血凝试验 Nielson 报道间接血凝试验(indirected hemagglutination assay , IHA ) 在血清6和8型之间有交叉反应, 但它能将血清型4和7分开。国内逯忠新等[10]报道, 经戊二醛2鞣酸化处理的绵羊红细胞用胸膜肺炎放线杆菌抗原致敏, 以IHA 检测猪传染性胸膜肺炎病猪血清抗体。致敏红细胞
其病变主要表现为不同程度的肺炎和胸膜炎。肺炎大部分为两侧性, 涉及心叶及尖叶和部分膈叶, 膈叶上的病灶常常是局部的, 而且界线分明。在迅
100动物医学进展 2008年 第29卷 第2期(总第174期)
抗原的最佳浓度为100μg/mL ～150μg/mL , 超免
血清的抗体效价达1∶512～1∶1024, 对人工感染14d 的猪血清阳性检出率达80%。与猪瘟、猪肺疫、猪喘气病、猪萎缩性鼻炎阳性血清无交叉反应。本检测方法适用于猪传染性胸膜肺炎流行病学的调查和定性。IHA 具有敏感、特异和可早期诊断的特点, 且操作简单, 适合于在生产中推广应用。
5. 2. 4 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(enzyme 2linked immuno sorblent assay , EL ISA ) 方法敏感性好, 简便, 快速, 可方便的用于临床诊断、实验室检测和血清学调查。用于检测App 的EL ISA 方法主要有两种, 一种是Nicolet J 等建立的EL ISA 代替CF T 作为App 的分型方法; 另一种是种特异性EL ISA , 由于EL ISA 对抗原纯度要求很高, 因而对其改造主要在于抗原的纯化[11]Ap X Ⅱ, EL 6 防控方法
猪传染性胸膜肺炎发生呈递增趋势, 且以多发
性浆膜炎和关节炎及高发病率和高病死率为特征, 影响猪生产的各个阶段, 给养猪业带来严重损失[13]。疫苗免疫是控制App 感染的有效手段, 实行疫苗接种, 可提高猪体的特异性免疫抵抗力。抗体具有较好的保护作用, 母源抗体可以保护仔猪5周～9周。6. 1 灭活苗
灭活苗不能刺激动物产生高滴度的抗体, 当动物受到感染时, 临床症状和肺的损伤都会出现[14]。, [15]研究表明, []A PPl 、2和5型三价混合, 逯忠新等[10]也研制出了App 血清1、3、7型三价灭活苗, 分别进行了临床试验, 结果表明, 免疫效果得到了一定程度的提高。罗马尼亚取得专利的疫苗是由灭活的和被吸附的App (40%) 、多杀性巴氏杆菌(30%) 和支气管败血博代菌(30%) 混合培养物研制的三联苗, 也取得了较好的效果[17]。6. 2 亚单位苗
研究表明,l 型App 的细胞抽提物的保护力比灭活苗和外膜脂蛋白的制剂更好, 其细胞抽提物的主要成份是11ku 的溶血素[18]。用经福尔马林灭活的1型或5型的细菌与纯化的Ap X Ⅰ共同免疫小鼠, 不仅对其相应的血清型起到了完全的保护, 而且彼此之间具有交叉保护力[19]。在App 的急性感染中,Ap X 和OmlA 在提供保护方面起着至关重要的作用。
近几年, 对App 的主要毒力因子进行分子生物学分析, 通过研究App 的毒素分子致病机理而研制出一种更为有效的亚单位疫苗[20]。研究表明,Ap x 2IN 2末端40个～280个残基的片段被用作亚单位疫苗时, 可诱导出对异种血清型的致死性感染的保护力[21];App 的荚膜多糖溶血素蛋白和脂多糖溶血素蛋白联合疫苗能激发机体的免疫应答, 可抵抗App 的内毒素、外毒素和溶血活性毒素[22]; Richand 对App 的外膜蛋白(OM P ) 免疫原性进行了研究, 发现针对至少4种OM P 的抗体对至少9种血清型中的多数细菌有交叉保护作用[23]。可见, App 的OM P 有望成为预防该病的有效疫苗。6. 3 弱毒疫苗
自然康复猪可以抵抗所有血清型的感染。这就
诊断方法, Ⅱ可以表达, , App 。用此方法共检测了400份血清, 其中阳性243份, 阴性157份。检测结果与CF T 试验的相关性很高, 且敏感性也比CF T 高。5. 2. 5 其他血清学检测方法 用于App 诊断的其他血清学方法还有乳胶凝集试验(latex aggt utina 2tion test , L A T ) , 免疫扩散试验(immunodiff usio n test , IT ) , 环状沉淀试验(ring p reipitation test , RP T ) , 间接荧光抗体技术(indirect flurorescent an 2tibody test ,IFA ) 等。5. 3 分子生物学检测方法
Frey J 等[12]建立的PCR 检测方法, 是通过不同
的引物对扩增App 毒素的激活基因和结构基因Ap XI CA 、Ap X ⅡC 、Ap X ⅢCA 以及部分分泌基因Ap XI BD 、Ap X ⅢBD 的一个特征部分。不同的引物
对在两个不同的PCR 试验中分别扩出2条和3条扩增带, 根据扩增产物长度的不同, 进行分辨和确诊。
王牟平等[13]根据已发表的App Ⅳ毒素的基因序列, 设计合成了2对引物, 建立了套式PCR 方法, App 血清1、2、5、6、7、9型均可扩增出448bp 和365bp 的特异性条带。套式PCR 检测的灵敏度可达50个细菌, 最低检出DNA 浓度可达58. 5pg/mL 。作者对5株从病猪体内分离的App 进行了检测, 均为阳性; 对10头屠宰猪的肺脏分离物进行了检测, 结果1份为阳性。据此认为, 此PCR 方法特异性和灵敏性均很高。
唐文山等:猪传染性胸膜肺炎研究进展101
提示可以研制弱毒疫苗用于免疫, 从而获得高效的保护力。
App 温度敏感突变株、荚膜多糖缺陷、核黄素营养缺陷型和脲酶阴性表型突变株均可作为减毒疫苗的候选[23]。Ro sendal S 等[24]将一株1型的App 在体外传代70次, 使其荚膜从原来的137nm 减少到53nm , 而其他成分Oml 、Ap x 都末发生变化, 结果荚膜变薄菌株的毒力已减弱, 这与Inzana 的研究结果一致。Inzana 用乙基甲硫酸对App 进行诱变, 得到荚膜完全缺失的突变株。以大于亲本株LD 50的量经气管接种动物, 并没有出现临床症状和肺损伤, 而且对动物产生了很好的保护力。荚膜不能对动物提供充分的保护, 但荚膜却为App 的毒力所必需[15]。所以荚膜缺失的菌株在毒力减弱的同时, 并不影响其保护力。
总而言之, 较理想的程苗。叉保护力, 而且使用方便成本低, 是今后App 疫苗的发展方向[25]。但近年来应用较多的是亚单位疫苗和灭活苗。制备灭活苗时, 应选择当地分离的具有较强毒力的优势血清型菌株来制备, 因其可以提供较为充分的菌体及毒素抗原, 产生最大限度的保护。而在亚单位疫苗的制备过程中, 要注意不同的抗原成分最好使用不同的血清型菌株制备, 以最大限度的提高疫苗的交叉保护性。参考文献:
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动物医学进展,2008,29(2) :1022105Progress in Veterinary Medicine
硬皮病动物模型及其应用研究进展
巫婷婷1, 周京国2
(1. 成都中医药大学临床医学院, 四川成都610075;2. 川北医学院附属医院风湿免疫研究所, 四川南充637000)
摘 要:硬皮病是一种以组织纤维化、闭塞性血管炎和产生大量自身抗体为特征的结缔组织病, 病因及发病机制至今尚未完全明了, 尚无理想的治疗药物和方法。该文对建立硬皮病模型动物的选择进行了比较, 介绍了应用博来霉素诱导Balb/c 小鼠产生硬皮病样病变以及应用V 型胶原重塑新西兰兔硬皮病样改变等建立硬皮病模型的方法, 对应用这两种动物模型研究硬皮病发病机制和中药临床治疗研究概况进行了综述。 关键词:硬皮病; 动物模型; 应用
中图分类号:S857.5
文献标识码:A
() 0220102204
硬皮病(Scleroderma , Scl ) , 3个基本过程, 、[1]。该病的病因及发病机制至今尚不完全清楚, 尚无理想的治疗药物和方法。硬皮病临床基础研究, 因患者依从性较差, 取材较困难, 因此建立合适的硬皮病动物模型, 选择合适的模型动物和试验方法, 对于阐明发病机制和治疗具有重要意义。1 硬皮病模型动物的选择
在试验研究中, 选择合适的动物建立硬皮病模
, 。曾有选取紧皮鼠(tight skin mouse ) 、UCD (U 2niversity of California at Davis ) 鸡等可自发产生硬皮病的动物, 但因来源困难、操作复杂而很难推广。将博来霉素(bleomycin , BL M ) 注射于普通小鼠和sp rague 2dawley 大鼠, 其皮肤硬化均不明显, 说明普
通小鼠和sprague 2dawley 大鼠并非是硬皮病模型的理想动物[2]。 自发产生和诱导产生硬皮病的动物模型已被广泛研究, 虽然没有动物模型能完全重塑硬皮病多器官纤维化、炎症和血管功能障碍三大特征, 但可选择
收稿日期:2007210224
作者简介:巫婷婷(1982-) , 女, 四川成都人, 硕士研究生, 主要从事风湿免疫疾病研究。
[24] Rosendal S , Devenish J , Machines J L , et al. Evaluation of
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49:105321058.
Progress on Porcine Contagious Pleuropneumonia
TAN G Wen 2shan 1,L I Xin 2
(1. College of V ocational Technique of A ni mal H usband ry and V eterinary Medicine , H uangy uan , Qi nghai , 812100, China;
2. Guinan A ni mal H usband ry and V eteri nary Medicine S t ation , Gui nan , Qinghai , 813100, China )
Abstract :Porcine contagious pleurop neumonia (PCP ) has been one of important swine contagious diseases in t he world . Pat hogen 2Acti nobacill us pleurop neumoni ae (App ) mostly settles down in porcine respirato 2ry t ract ,and has st rict host specificity. Many test s ,such as complement fixation test (CF T ) ,enzyme 2linked immunosorblent assay (EL ISA ) ,latex agglutination test (LA T ) ,indirect fluorescent antibody (IFA ) ,etc. have been established for detecting PCP and epidemiological research. The preparation ,classification and application of it s vaccines were reviewed in t his article. K ey w ords :PCP ;diagno sis ;vaccine