定量核磁共振技术在中药分析中的应用
[摘要] 综述定量核磁共振技术的基本原理、优点以及在中药分析中的应用进展。定量核磁共振作为一种定量分析方法, 专属性强、准确快捷, 可与其他定量方法相互补充, 用于中药分析领域的诸多环节, 如纯度分析、中药鉴定、中药活性成分的含量和中药活性成分体内定量分析等, 有很好的应用前景。
[关键词] 定量核磁共振；qNMR ；中药活性成分；中药分析
目前，化合物的含量测定通常采用仪器分析法，包括色谱法(如HPLC 法和GC 法) 、光谱法(如紫外光谱法和原子荧光光谱法) 以及各种联用技术。这些方法准确、可靠，但因方法建立过程烦琐，且需提供对照品，故只能用于已知化合物的分析；此外，这些方法对待测样品纯度要求高、样品预处理过程复杂等因素也在一定程度上限制了其应用。定量核磁共振技术作为一种正在高速发展并不断成熟的仪器分析方法，具有与这些传统方法无法比拟的优势，目前，核磁共振法已经在有机化合物的结构解析和定性分析中广泛应用，但其实它在化合物的纯度测定、含量测定中也同样具有很多优势，所以定量核磁共振法(qNMR)越来越引起研究人员的重视。
自20世纪50年代核磁共振仪问世后, 就有人尝试将其用于化合物的含量测定。1963 年，Hollis(AnalChem)使用100 兆的核磁共振仪分别测定了制剂中阿司匹林、非那西汀和咖啡因的含量。但在当时，因为仪器磁场强度低，测定误差较大，该技术并未得到广泛应用。随后，高磁场核磁共振仪及超低温探头的出现，使对低含量化合物的定量测定具备了可行性。20世纪70 年代，脉冲傅里叶数字变换技术及化学计量学被陆续引入NMR 技术，使其定量准确性大幅提高。根据国际计量局在1995年提出的不确定度分析方法[1] ，Malz 等[2]对QNMR 法相关实验参数进行了优化，使所得方法的不确定度低于1.5%，至此,QNMR 已发展成熟。目前，QNMR 检测限(LOD)和定量限(LOQ)均可达到毫摩尔水平[3]，能准确检测摩尔分数低至0.1 %的物质[4],可在一定程度上替代高准确度和精密度的色谱法, 特别是对于那些尚无对照品的创新药物的定量以及对照品的标定工作, 可考虑将QNMR 作为首选的分析方法[5]。近十年来，定量核磁技术被广泛引入中药分析中并取得了不错的成果。本文将介绍定量核磁共振技术的基本原理、优点以及近十年来其在中药分析中的一些具体应用。
关于定量核磁共振技术
1.1定量核磁共振的原理
核磁共振图谱中响应信号强度一般用峰面积(A)表示。其计算公式为:A=k·N 其中, N 为待测物分子中被激发的原子数目k 为光谱常数, 在同一次测定中, 所有激发原子的k 均相同，故A 与N 成正比，可根据待测物信号强度确定其含量。据此公式可知, 减少误差的关键是测得准确的N 及A 值。使用高精度的分析天平即可减小N 的误差, 优化实验条件则可提高灵敏度, 减小测量误差, 以获得准确的A 值。该法的灵敏度取决于待测物激发态原子数(Nα) 与基态原子数(Nβ) 的比值比值越高, 灵敏度就越高。其计算公式为:Nα/Nβ=exp (-γhB0/2πkT) ，其中，B0为磁场强度，T 为绝对温度，k 为Boltzmann 常数，h 为普朗克常量，γ为所测定原子的磁旋比。由此可知，对实验条件进行优化，如提高磁场强度，选择低温探头即可提高检测灵敏度。此外，磁场均匀度和扫描时间可通过影响峰形来改变信号强度；增加样品浓度及扫描次数等方法也可提高灵敏度；足够的弛豫时间能确保已激发的原子有充足时间恢复到基态并再次激发，从而使信号多次采集并积累, 提高灵敏度。近来研究显示：若要在确保定量所需准确度的前提下缩短测定时间, 一般可选择30度左右的脉冲角，以及保证信噪比至少大于150：1[2]。初步选定实验参数后，通常先采用已知含量的待测物或待测物结构类似物
进行测定以摸索合适的实验条件，然后再进行待测物的测定[6]。图谱的后处理(包括傅里叶变换、相位校正、基线校正和积分等过程) ，可在一定程度上改善峰形，减小积分误差，从而获得理想的测定结果。qNMR 常用定量方法包括绝对定量法和相对定量法。绝对定量法是指以结构和含量已知的化合物作为内标，与待测物制成混合液同时测定，通过两者峰面积的比值确定待测物的含量，其适于无对照品的新药含量测定[7]。相对定量法是指对含有两种或两种以上成分的混合物，直接比较其峰面积来确定其相对含量，适用于药物杂质检查、中药及复方制剂中各成分相对含量测定、药物代谢研究等[8]。对于待测物及内标，均应尽量选择含多个原子的孤立尖锐单峰作为定量峰，以保证有足够的积分范围; 若化合物中多个峰均符合条件，最好全部采用，以减小试验误差。定量峰重叠问题在化合物测定中很少遇到，如Rizzo 等[8]曾使用qNMR 法对98种纯度均在80%～100%间的药物进行含量测定，结果，因定量峰重叠而无法测定的药物只有2种；且对于某些定量峰有重叠的样品，也可通过做差、加入化学位移试剂、改变溶剂等方法解决[9]。
选择内标应满足含量准确、化学性质稳定、溶解性好、其定量峰与待测物定量峰不重叠等要求。常用内标有硅烷类如四甲基硅烷(TMS)、3-(三甲基硅基) 丙酸钠-2，2，3，3-D4 (TSP)、芳环类(如1，4-二硝基苯、香豆素、苯甲酸) 、简单烷烃类(如3，4-二硝基甲苯、苯甲酸卞酯、马来酸) 以及其他化合物(如L-亮氨酸、异烟酰胺和咖啡因) 。除化学物质做内标外，也有人尝试将电极作为内标使用，如Akoka 等(AnalChem, 1999年) 采用化学电极内标，根据其产生的电信号进行含量测定，相比于常用的化学物质内标，其最大优点是对样品无污染。
1.2 定量核磁共振的优点:
1) 核磁共振波谱可以用于定量分析是因为不同化学环境中的原子核共振吸收峰面积只与它的原子数有关，因此，无需引进任何校正因子，也不用为每一种被测物选择相应的标准品，与传统的定值方法相比，其具有不容忽视的优势。
2) 核磁共振波谱信号直接与化合物基团上的共振原子数目成正比，被测物的量值可被直接溯源到内标上，它还具备其他常用化合物纯度定值所不具有的优势。如果选用的内标物是通过基准方法溯源至国际单位制的标准物质，就可以直接将被测物的量值溯源至国际单位制。因此，近年来各国际标准物质研究机构都开展了qNMR 研究。
3) 对被测化合物的要求低，只需要含有氢、碳或氮等元素，可对绝大部分有机化合物的纯度与含量进行定量。
4) 对被测化合物的纯度要求不是太高，因为只要化合物结构有较小差异，核磁共振谱图就有所不同。
5) 仪器操作简单，分析速度快。只需要将被测物与内标物准确称重并且溶解于同一种氘代溶剂，就可以在仪器中进行检测。
6) 灵敏度随扫描次数增加，灵敏度与扫描次数的平方根成正比，可以通过增加扫描次数，获得较高灵敏度。
7) 分析方法的机理和计算公式明确，容易对测量的影响因素和不确定度进行分析。 8 ) 不破坏样品也是其显著优点之一。
2.qNMR 在中药分析中的应用
中药成分分析中最常用的方法是高效液相色谱法（HPLC) ，但此法有以下不足：分析时间长、分离效率低；因色谱柱被污染造成色谱柱使用寿命缩短；色谱柱上沉积的污染物，常以杂质峰的形式出现；对于含极性成分较多的中药，其“指纹”的特征不强。近年来国、内外研究者都在尝试寻找更好的方法进行中药材分析研究，于是qNMR 技术被引入中药分析中，现已成为中药质量控制、中药活性成分体内定量分析等的重要方法之一，与中药分析的结合更是具有广阔的发展前景。
2.1纯度分析
李建发[8]以吡嗪作为内标物, 采用qNMR 法对葛根素(1)标准品的含量进行测定, 最终准确计算出葛根素的含量。同样, 李建发[9]也采用该方法测定了橙皮苷的含量。 Jaki 等[10]采用qNMR 法测定具有抗结核作用的熊果酸的纯度, 并在此基础上提出了基于天然药物纯度与活性关系的纯度-药效关系(PARs)理论。薛松[11]等采用qNMR 法确定繁茂膜海绵中分离得到的结构类似的类固醇化合物纯度, 这种方法为鉴定分析组成复杂而性质相近的天然类固醇化合物提供了新思路。
2.2中药鉴定
中药材由于其生长环境、采收季节、加工方法和贮存条件不同, 其所含化学成分、量以及临床疗效也有很大差异。NMR 技术在鉴定中药品种和基源等方面发挥了关键作用。
Gang 等[12]采用qNMR 法测定不同品种的黄连, 如黄连Coptis chinensis Franch 、三角叶黄连Coptis del-toidea(C. Y. Cheng et al) Hsiao 和云连teetoWall 中6种原小檗碱类生物碱含量。Kang[13]采用qNMR 法分析植物代谢产物以区分中国和韩国两产地的人参根粉末。同时,He[l4]用qNMR 法分析灵芝(Ganoderma ZwcidMm)代谢产物, 从而鉴定中国产和韩国产的灵芝。 江洪波[l5]等采用技术，以标准麦门冬为参照，测定产地为绵阳的优质新麦门冬、陈年麦门冬、硫熏麦门冬等中的主要化学成分含量。结果表明不同品种、不同产地、不同年份、不同炮制方法得到的麦门冬其化学成分的种类和相对含量存在明显差异。
2.3中药活性成分的含量
测定中药的药效往往是多种活性成分共同作用的结果，确定其各活性成分的含量是中药药效物质基础研究的前提。近年qNMR 技术迅速发展为测定中药活性成分含量开辟了一条新道路。
Li[16]等采用qNMR 法快速测定了中药黄柏（关黄柏川黄柏及其复方制剂中原小檗碱类生物碱——小檗碱（3）和巴马丁（4）的含量。此外，Li[17]等HPLC 法和qNMR 分别采用法和法测定喜树根中喜树碱及其衍生物的含量, 两种方法的相关系数均大于0.999。相比HPLC 法,qNMR 在绘制标准曲线时具有无须标准品，可用粗提物直接定量的优势。
二萜类化合物穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和新穿心莲内酯是穿心莲抗炎、抗病毒作用的主要成分。Yang[18]等采用qNMR 技术测定3种中药制剂的二萜类含量。脱水穿心莲内酯（13) 是3种穿心莲制剂的主要化合物，穿心莲内酯在消炎利胆片和妇科千金片中未被检测到。Liu[19]等采用qNMR 法比较不同产地的黄花蒿样品，并与液相色谱质谱联用技术、高效液相色谱蒸发光散射法和薄层色谱法的结果相比较。结果显示qNMR 法可准确用于定量黄花蒿样品。
2.4中药活性成分体内定量分析
在进行中药活性成分体内药动学和有效性研究时，需要测定生物样品中的中药活性成分或其代谢物的含量, 生物样品中原形药物及其代谢物浓度通常很低，而且存在内源性干扰物。目前，体内原形药物及代谢物分析常采用LC-MS 法，它只能对结构相近的代谢物提供有限的结构信息[20]，而qNMR 法则具有简便性、高分辨率和多目标性, 且不破坏化合物结构, 可提供比LC-MS 法更多的结构信息[21]。比如Moazzami[22]等就采用了qNMR 法测定了芝麻脂素在人体内的代谢物——儿茶酚的含量。
3 小结
定量核磁共振法的测定过程简单，分析快速，集鉴别与含量测定于一身，且无需待测物对照品，使其在药物质量控制和新药研发中的应用日趋广泛。而同时qNMR 技术也有一定局限性：首先，化合物定量峰所归属的原子必须是已知的。因此不适于分析结构完全未知的样品；其次，与其他分析方法相比，qNMR 法灵敏度较低, 对浓度极低的样品如生物体液中的原形药物及其代谢物不能直接测定；再者混合物中定量峰重叠, 虽可对其进行处理, 但因步骤过于烦琐, 实用性不佳。为此，研究人员通过不断尝试，已提出一些改进方案，相信通过进一步
研究，这些问题会逐步得以解决。在不久的将来，qNMR 法有望成为主流定量方法，相信随着技术在中药分析领域应用的不断深人，能为中药分析开拓新思路和新方法。
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