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・综述・
表皮干细胞表面标志物的研究进展
王
瑶1
刘志跃1
刘文忠1
李建福2
(1.内蒙古医学院病理生理学教研室,内蒙古呼和浩特010059;2.第三军医大学西南医院整形外科,重庆400038)
表皮干细胞(epidermalstemcells,ESCs)是来源于胚胎外胚层的皮肤组织的专能干细胞,可以分化成各种表皮细
胞,使表皮始终处于持续的增殖、分化、脱落、消亡状态,大约每月更新一次,并且增殖与消亡的速度保持大致平衡,从而保证了皮肤形态和功能的完整性。Liang等口]还发现ESCs在一定的环境条件下还可能具有胚胎细胞的多能性,是潜在的多能干细胞,具有较强的可塑性。随着时代的进步,ESCs越来越多地被应用于组织工程、细胞替代治疗、基因工程等科技领域,所以对ESCs进行精准地鉴定显得日益迫切与重
要。本文就ESCs表面标志物的研究进展综述如下。
1
ESCs的生物学特性1.1
ESCs的分布
ESCs是组织特异性干细胞,在胎儿时
期主要集中于初级表皮嵴,至成人时呈片状分布在表皮基底层和毛囊隆突部,即皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘,在基底层中约占1%~10%。在没有毛发的部位如手掌、脚掌,ESCs则位于与真皮乳头顶部相连的基底层。ESCs可以通过不对称分裂完成自我更新并且分化形成
短暂扩充细胞(transitamplifyingcells,TA细胞),后者经多
次分裂后定向分化为有丝分裂后细胞和终末分化细胞。外层终末分化细胞的死亡脱落与基底干细胞的分裂维持动态
平衡,从而维持正常的组织结构[2’3]。
1.2
ESCs的特性ESCs通常处于静息状态,表现为细胞
体积小、细胞器稀少、RNA含量低等一些较幼稚细胞的特征。此外它还有3个典型特点:①慢周期性。表现为活体细胞标记滞留,这类标记滞留细胞在体内分裂很慢,以保证其巨大的增殖潜能和减少DNA复制时出错的几率。②自我更新能力强。ESCs体外培养时细胞呈克隆状生长,连续传代培养时,细胞可进行140次分裂,可产生1×10‘0个子代细胞,维持组织的再生和长期动态平衡。③对皮肤基底膜的黏附性。ESCs主要通过整合素(integrins)实现对基底膜的黏附,这也是干细胞维持其未分化特性的基本条件,也是诱导干细胞脱离干细胞群落、进入分化的重要调控机制之一L4刮.
2
ESCs的鉴定方法
2.1依据生物学特性鉴定
2.1.1标记滞留细胞分析法
由于ESCs的细胞周期长,在
DNA合成过程中用核素等标记物标记核苷酸,被细胞摄取并整合到DNA中的标记物可以滞留很长一段时间;而TA
万方数据
细胞增殖快,标志物很快被稀释,因此检测不到。故可采用标记滞留法识别在体的静息干细胞,常用的标志物有用氚标记的去氧胸腺嘧啶苷(3H—dT)或胸苷类似物5一溴一2脱氧尿
苷(BMU)。
2.1.2依据细胞形态特点及细胞周期鉴定ESCs具有幼稚细胞的超微结构及形态特征,显微镜下其形态较为原始,
具有体积小、胞核大、核质比高、细胞内RNA含量低等典型
非成熟细胞特点,且在显微镜下折光性强,胞体透亮度好。但是,要从形态学上区分ESCs及其子代细胞是很困难的,因此形态学特征只是作为参考。细胞周期分析发现,ESCs有较长的GO/G1期,能将DNA复制错误几率降至最小,且具
有自我更新分化成表皮中各种细胞的能力。Papini等J3将所分离的ESCs接种在胶原支架上进行三维培养,能够形成与在体表皮相似的结构,这是鉴定ESCs最有说服力的方式.2.1.3克隆分析法ESCs在体外形成全克隆,而TA细胞形成次克隆,通过对克隆形成力的分析可以进行干细胞的体外鉴别。将单个干细胞接种培养,若能形成全克隆,并能连续传代,就可以鉴定其为ESCs。这是鉴定ESCs比较有力的
方法。
2.2依据ESCs表面标记物鉴定主要的方法是分子标记
法。鉴定ESCs的关键是要找到特异的细胞表面标志物。目前关于ESCs的标志物主要有整合素、角蛋白(keratins)、增
殖细胞核抗原(PCNA)、基因物质p63及CD71、连接蛋白43
(connexin
43,Cx43)、C8/144B以及CD34等[““。
虽然当前用于ESCs分离与鉴定的表面标志物有很多t国内外对ESCs表面标志物的研究也取得了一定的进展,但尚未能找到一种绝对的公认的ESCs标志物。鉴别ESCs多需联合多种ESCs标志物并结合其生物学特征。ESCs区别于TA细胞的主要特征有慢周期性、自我更新能力强及某些表面标记的不同表达程度等,这些特点目前常被用于ESCs的鉴别与纯化。
3
EScs的表面分子标志物
3.1整合素整合素是一类位于细胞膜表面的糖蛋白受体
家族分子。ESCs是整合素表达水平最高的一类细胞,主要通过表达整合素实现对基底膜各种成分的黏附。而ESCs对
基底膜的脱黏附是诱导其进入分化周期并最终脱落的重要调控机制之一[1“。在ESCs中高水平表达的整合素有a2p1,a3p1和a5p1及a6114。其中a2fll整合素是胶原和层粘连蛋
・
56
・
白(LN)的受体,是区分ESCs与TA细胞与终末分化细胞的第一表面标志物。ESCs和TA细胞表面高表达p1整合素,而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达p1整合素,因此可用p1整合素的抗体来加以区别。同时,ESCs的阳整合素表达量是TA细胞的2倍,在激光共聚焦显微镜下能分辨其差异。通过RNA干扰技术下调ESCs中B1整合素的表达,可以观察到ESCs启动分化,克隆形成能力明显降低[1“,说明p1整合素在保持干细胞特性方面具有重要作用。此外还发现p1整合素表达水平的高低与细胞体外克隆形成能力
成正相关n“。
另外,p1整合素阳性细胞也高表达a6整合素。a6整合素通过半桥粒介导基底细胞与基底膜的黏附,也被认为是ESCs的表面标记。因为能与基质发生快速黏附的p1及a6整合素阳性细胞并非全部是干细胞,还包括TA细胞,有学者用免疫荧光法检测a6整合素及另一个与增殖有关的单克隆抗体10G7来区分ESCs、TA细胞和终末分化细胞,a6表达阳性和10G7表达阴性为干细胞;d6和10G7表达均阳性
的细胞为TA细胞;a6表达阴性和角蛋白10(K10)表达阳性的细胞为终末分化细胞[1“。3.2角蛋白
角蛋白是表皮细胞的结构蛋白,它们通过直
径为10rim的微丝在细胞内形成广泛的网状结构,在人体的
上皮组织中有不少于20种不同种类的角蛋白表达。不同分化程度的表皮细胞表达不同的角蛋白,因而可用于鉴别ESCs、TA细胞和终末分化细胞。ESCs表达角蛋白19(K19),K19是已知角蛋白家族中最小的一个,分子质量仅有
40
kDa,其在多种组织中均有表达,在新生儿皮肤基底层中有K19表达,成人无毛囊皮肤如手掌、脚掌等部位基底层的干细胞K19表达阳性,而有毛发的皮肤基底层中ESCs的K19表达则呈阴性。TA细胞往往表达K5和K14,终末分
化细胞则表达K1和K10。毛囊隆突部ESCs还可表达K15,K15阴性而K19阳性可能是早期的TA细胞,因此K15可能
较K19对鉴别毛囊的隆突部ESCs更有意义。而谢举临等[143研究发现,干细胞能够表达角蛋白,其中K10是分化程
度高的表皮细胞的特征蛋白,因此可以说K10是ESCs和
TA细胞表面的阴性分子标志,故对于ESCs和TA细胞的
鉴定有重要意义。
3.3
p63
p63是一种肿瘤抑制因子,是与p53同源的转录
因子,p63蛋白亚型在人体组织中呈广泛且有选择性地表达,尤其在增生的上皮细胞内多见。p63和它的两个同源体p73、p53的结构极其相似,皮肤活检及正常人表皮细胞的原代培养细胞都表达p63和p73,p63以非活化形式DNp63存在于正常人表皮细胞中。有研究证实p63和p73均参与表皮细胞的终末分化。p63高表达于成熟表皮基底层的ESCs,随着角朊细胞(KC)的终末分化,p63表达下调[1”。p63在体
内的独立表达不足以用来鉴定ESCs,因为它在基底全层,大
量的基底上层细胞和毛囊的外根鞘部都有表达。因此需要与其他标志物共同来鉴定ESCs。
3.4
CD71
CD71为ESCs表面转铁蛋白受体。从细胞数
万方数据
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量、形态、分布部位、所含标记保留细胞比例等多方面看,低水平表达CD71的那部分表皮细胞均符合ESCs的特征[1“。
有学者采用细胞动力学分析结合特定荧光激活的细胞分选
法,从鼠背部TA细胞中成功分离出ESCs,并证实其具有高表达a6整合素和低表达转铁蛋白受体CD71的表型特性;相反,TA细胞则表现高表达a6整合素和高表达转铁蛋白受体
CD71(a6hCD71h)的特性。同时鼠背部皮肤的免疫印迹实
验也揭示了在毛囊隆突部有低表达CD71的细胞,即ESCs。3.5血管紧张素转化酶(ACE)
ACE已被发现存在于表
皮角质形成细胞的胞膜[17d8]。ACE和中性内肽酶(neutralendopeptidase)作为终止皮肤神经一内分泌介导子作用的关键酶调控着皮肤细胞的存活、创伤愈合和组织再生[1…。ACE
不仅在成人皮肤基底层部分的表皮细胞胞膜、汗腺和毛囊表
达,在胎儿皮肤发育过程中ACE与目前常用于鉴别ESCs的分子标志物p1整合素、K19、p63等呈现出几乎相同的表达变化和组织定位。这也说明了ACE与ESCs之间的密切关
联性以及ACE对ESCs可能的调控作用。
3.6
Cx43
Cx43属于连接蛋白家族,是存在于正常人皮肤
基底层的连接蛋白,每一个蛋白都是一种基因的产物。目前已发现十几种连接蛋白。研究证实在新生儿包皮基底层和
毛囊隆突部约10%的细胞缺乏Cx43表达[2…。而鼠皮肤的
实验研究表明,大多数慢周期细胞不表达Cx43,少量表达Cx43的标记滞留细胞可能是TA细胞[2…。因此认为Cx43
可作为ESCs的阴性表面标志物。3.7细胞内PCNA
程大胜等[21]采用流式细胞仪检测
E:scs表面p1整合素、CD29和PCNA的荧光标记强度,PCNA在细胞核内合成,其量的变化与DNA合成相一致,是评价细胞增殖状态的一个指标f对不同的Ⅳ型胶原黏附时间及细胞
周期进行分析,结果显示,CD29+/PCNA-与鉴定干细胞的基
本指标均具有良好的相关性,可以作为ESCs的检测指标。3.8端粒酶染色体末端由重复的DNA(TTAGGG)序列所组成的端粒序列的丢失被认为和细胞的衰老和老化相关。端粒长度的维持即重复序列向染色体末端的添加由端粒酶催化。端粒酶组成成分包括:RNA组分(hTR)、端粒酶相关
蛋白(TEP)和端粒酶逆转录酶(TERT)[22’23],其中TERT对
端粒酶活性起关键作用。人体大多数正常细胞和组织中端粒酶均无活性,在干细胞中端粒酶的适量表达有助于干细胞
的增殖分化。目前研究证实,在表皮基底层细胞及新生儿包
皮中端粒酶均有活性表达[2“25],但对不同发育阶段皮肤ESCs的端粒酶活性表达特征仍缺乏相应的了解。胎儿皮肤来源、少儿皮肤来源和成人皮肤来源的ESCs均有端粒酶活性表达,其表达由强到弱依次为人胎儿皮肤来源ESCs、少儿
皮肤来源ESCs、成人皮肤来源ESCs。提示端粒酶活性表达
可以鉴定ESCs在体外的自我更新和增殖能力。
3.9桥粒蛋白
Wan等[26]报道了鉴别、分离ESC¥的一种新
方法。当角质形成细胞分化、成熟并从皮肤的基底层向表皮迁移时,上皮细胞之间互相连接的特殊结构——桥粒增多;在对琰℃s分化过程的研究中他们还发现,随着ESCs的分化,桥
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粒蛋白如desmogleins(Dsg)和desmoplakin表达增加。利用高表达的p1整合素和低表达的Ds93,研究者获得了高纯度ESCs。因此,桥粒蛋白可作为表面标志物用于鉴定ESCs。3.10胰岛素样因子(IGF)及胰岛素样生长因子结合蛋白
(Igfbp)IGF信号系统已被认定是调控细胞增殖的关键媒
介之一。研究证实,真皮的Igfbp3基因表达减少导致了皮肤
老龄化,虽然它的缺失并未与老化表现直接相关,但它通过
对IGF的作用来达到调节ESCs的生长和分化。随着皮肤的老龄化,ESCs的Igfbp3表达减少,而IGF/Igfbp[z7-29]信号系统通过影响组织的生长、糖酵解、脂代谢等过程,则逐渐成为许多皮肤细胞成熟老化过程的金牌标志物。
4展
望
ESCs在创面愈合过程中扮演着重要角色,是皮肤发生、修复、改建的源泉,研究其增殖、分化及调控机制,对于促进皮肤结构和功能的生理性修复具有重要意义[3“31]。ESCs具有无限增殖和多向分化潜能,对今后进行表皮重建将具有重大实用价值,虽尚有许多问题亟待解决,但相信随着科技的
进步,随着分子生物学、分子遗传学、组织重建工程等学科的发展,使创伤修复无论是在形态还是功能上都达到综合康复已经不再只是个梦想,ESCs的研究也将在整个生命科学领域产生极其深远的影响。
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