特殊生物显微镜的原理与使用
一、实验目的
1、了解和认识各类常见特殊生物显微镜的工作原理及运用范围；
2、操作并掌握相差显微镜和荧光显微镜的使用范围及使用方法；
二、实验原理
相差显微镜：
1. 原理
1.1. 相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。
1.2. 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置) 的不同。当一束平行光通过被检测标本, 遇到一种物点时, 由于各物点对光的吸收程度不同, 在显微镜视场中可见到灰度( 即明暗度) 不同的各物点图像, 这是由于光的振幅不同所致。如果标本中的物体近乎透明, 视场中就看不出明显的灰度差别。但由于各种物点对光波产生了衍射和折射, 使得通过的光波因延迟而发生了偏离, 其光程就有了一定的差别, 即产生了所谓“位相差”。
2. 结构：
2.1. 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜(通常标有PH 的标记) 代替普通物镜，并带有一个合轴调节用的望远镜。
2.2. 功能：相差显微镜具有两个与其他显微镜所不具有的功能:
①将直射的光(视野中背景光) 与经物体衍射的光分开;
②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。
3. 注意事项：
3.1. 视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。
3.2. 不同型号的光学部件不能互换使用。
荧光显微镜：
1. 原理：
1.1荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650nm λ或蓝光4200nm λ) 作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。
1.2. 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光。
2. 结构：
2.1. 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等) 的基础上组成的。
三、实验步骤
相差显微镜：
（1）相差装置的调换安装
卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。
（2）调焦
打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40X 时应用40X 标示孔的光阑。
（3）合轴调整
拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。
（4）观察
换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。
荧光显微镜：
1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。
2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。
3. 放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤。
4．高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经15-30分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
5. 使用完毕后，应将灯源开关调置到最弱位置。
四、思考题
1、为什么说倒置、相差显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜?
答：在显微镜下镜检时，视场中的样品只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化, 即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。相差方法能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色合活体以有害的影响, 甚至失真。
2、荧光显微镜两种滤光片（激发光和阻断滤光片）作用是什么？
答：激发光滤光片:激发光滤光片可以选择性吸收长波谱线而吸通透紫外线，紫色，蓝色和绿色光线的滤光片为激发滤色片。
阻挡滤光片:阻挡滤光片是选择性吸收短波谱线和红外线而通透较长波长可视线的滤光片，其功能是使观察都能看到被检物体所激发出来的荧光，同时保护观察都的角膜免遭紫外线伤害。