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临床检验杂志2007年第25卷第4期 ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vol125,No14
文章编号:1001-764X(2007)04-0308-03 中图分类号:R446.12 文献标识码:A
#基层教学#
相差显微镜的原理、结构和临床应用
朱晓辉,朱忠勇(南京军区福州总医院全军检验医学研究所,福州350025)
关键词:相差显微镜;基本原理;临床应用
在显微镜下准确辩认各种正常和病理物质,是检验工作
者的基本功。生物标本中的细胞、细菌等微小、透明的物体,对光的吸收率和折射指数等与周围的介质近似,在一般光学显微镜下,往往看不清其明显的轮廓和细致的内部结构。用特殊的染色法虽可清楚地看到细胞的形态和某些内部结构,但也有局限性:①有些生物体不易被现有的染色法染色;②染色前先要对标本/固定0,使细胞形态稳定并使标本牢固地粘附在玻片上,因此看到的是经过固定的死细胞,而不是其自然状态;③细胞各部分不同颜色和颜色的深度,反映的是细胞内各种化学成分对不同染色剂的反应和亲和力,有时与真实情况相去甚远,甚至给人以假象。例如,经瑞氏(Wright)染色后的血片,中性粒细胞染成有多个深紫红色的核、胞浆内含颗粒的大细胞;它比染成淡粉红色的红细胞似乎更重,密度更高。而实际上,红细胞中含高浓度的血红蛋白,其重量和密度要比中性粒细胞大得多。祗是因为血红蛋白只被染料中的伊红着色,而不被其中的天青类着色,所以给人以又轻又小的假象。又如在病理条件下,有些细胞胞浆内会出现一些看上去像空泡的圆形小体,通常被称为/空泡0。事实上它并非空无一物,而含的是不被一般染料染色的物质(如脂肪)。
生物材料如果不经染色,在自然、活动的状态下能看清其形态和内部结构,是生物学界长期追求的目标。相差显微镜就是适应这一要求而发展起来的一种特殊的显微镜装置。
相差显微镜(phasecontrastmicroscope)是F.Zernike于1935年发明的(他因此获得了诺贝尔奖),至今基本结构没有多大改变。本文拟通过几个图解,介绍相差显微镜的基本原理和结构,同时简要介绍其组装、校准方法和临床应用。1 相差显微镜的基本原理
当一束平行光通过被检测标本,遇到一种物点时,由于各物点对光的吸收程度不同,在显微镜视场中可见到灰度(即明暗度)不同的各物点图像,这是由于光的振幅不同所致。如果标本中的物体近乎透明,视场中就看不出明显的灰度差别。但由于各种物点对光波产生了衍射和折射,使得通过的光波因延迟而发生了偏离,其光程就有了一定的差别,即产生了所谓/位相差0。人眼不能分辨这种位相差,但可以设法将这种位相差转换成振幅差。相差显微镜就是利用光的干涉原理,将位相差转换成振幅差(即明暗差)的显微镜装置[1]。
当一束光通过标本时会遇到如下情况:一部分光通过物点,经过衍射等发生偏离;另一部分没有被衍射、折射的非偏离光,则均匀地投射于像平面上。偏离光与非偏离光之间的光程相差约1/4,但此时两者不会产生明显的干涉。如果在显微镜的物镜与目镜之间加一个位相板(phaseplate,),使其
1达1/2),这图2 相差显微镜基本结构示意图
2 相差显微镜的基本构成
2.1 与聚光镜装在一起的可转换的环状光栏(annularring离光相遇,便产生明显的干涉(相互抵消),两种光波相遇形成的合成波的振幅为两者之差,光线明显变暗。而标本的介质,只有非偏离光通过,不发生干涉。结果形成暗色的目的物和明亮的背景的图像[2-5]。(见图1,2)。
图1 相差显微镜基本原理示意图
临床检验杂志2007年第25卷第4期 ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vol125,No14 或ringslit) 它是一套在黑色的玻璃片中,有一个无色透光圈的装置,分别适配低、中、高倍接物镜和油镜。由光源进入的光,只能通过透光环进入光路中。
2.2 带位相板的物镜 是在物镜透镜聚焦平面上加了一圈灰黑色涂层/板0的接物镜(肉眼可以看到黑色的圈)。
2.3 调焦(对光)目镜 原理类似一种望远镜(telescope),用于在显微镜中对上述两种装置的焦点调节,其长度可以通过手工改变。
2.4 一种绿(或青)色的滤光片。
以上4部分均由厂家配套供应,通常在使用前临时装于与之匹配的显微镜上,见图2。目前,国内外销售的高档显微镜,一般都备有相差装置。3 相差显微镜的使用
3.1 安装相差装置 将普通显微镜的聚光镜卸下,将带环状光栏的聚光镜装到相匹配的显微镜上;将显微镜的普通物镜卸下,换上带位相板的物镜;将目镜换成相差显微镜专用的调焦目镜;在光源进光处放置专用的绿色滤光片(有时可以不用)。
3.2 对光和聚焦 通过调焦目镜和粗细调节螺旋的调节,直至视野中可清晰地看到有一个白圈和一个黑圈。黑圈是固定的,白圈则可通过聚光镜装置上的调节螺旋加以移动,使黑圈与白圈完全重合。(见图3)。取下调焦目镜,换上显微镜原来的目镜,
即可进行检查。
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计数,曾定为血小板计数的参考方法(目前已建议用特异性血小板抗体荧光染色并用流式细胞仪计数)。新鲜血液直接用相差显微镜检查,可以观察到疟原虫滋养体在红细胞内呈阿米巴样活泼运动。也可看到中性粒细胞和单核细胞的运动和吞噬细菌和异物(如碳颗粒)等现象。
5.2 尿分析 用于辨认新鲜尿中各种细胞和管型,特别是透明管型、白细胞、肾小管上皮细胞以及红细胞形态的分类等。国外新开发的直接用于尿沉渣分析的仪器,例如iris尿沉渣分析仪,其显微镜部分就是流式的相差显微装置。5.3 微生物学检验 用于不染色或染不上色的细菌、螺旋体、真菌孢子等的快速辨认,特别是对具有鞭毛、荚膜等特殊形态微生物的鉴别。
5.4 对活细胞的连续观察 在细胞培养过程中,不允许对培养细胞进行染色。为了对活细胞连续观察,必须在专用的倒置显微镜中加相差装置。
目前国内市场上销售的,直接用于/疾病诊断0(?)的所谓/超高倍显微镜0,就是固定用其相差装置,检查新鲜体液标本。有些没有新鲜体液检验经验的检验人员,往往将肺部感染病人新鲜痰标本中常见的、一端带有纤毛并且纤毛不断快速摆动的柱状上皮细胞,误认为是新发现的寄生虫,并在一些杂志上发表。也有的单位用相差显微镜的高倍镜,检查新鲜血液和体液标本,把一些呈勃朗运动的微小物体,当作/支原体0报告。事实上用光学显微镜高倍镜是不可能看到支原体的,我们已在有关文章中作过专门讨论[6]。6 名词解释
6.1 光的衍射(diffractionoflight) 光波在传播过程中,遇到障碍物时,能改变方向,绕过障碍物继续向前传播,此种现象称为光的衍射,亦称绕射。
6.2 光的折射(refractionoflight) 光从一个介质射入另一个介质时,由于光波在两种介质中的速度不同,在其分界面处会发生传播方向的改变,此种现象称为光的折射。
图3 调焦使两圈重合示意图
4 相差显微镜图像的特点
相差显微镜有暗相差(darkcontrast,又称正相差,pos-itive)和明相差(brightcontrast,又称负相差,negative)之分,医学检验上一般多用暗相差。暗相差显微镜下看到的细胞和细菌,与染色后的见到的大不相同。例如,新鲜血液中的红细胞显得暗而厚重,且细胞周围有一圈明亮的晕(一般细胞、细菌等外周均有一圈亮晕,红细胞最为明显);中性粒细胞核不太明显,而胞浆中的颗粒却比较明显,与瑞氏染色结果恰恰相反。新鲜的血液中,还可以见到中性粒细胞的阿米巴样活动;细菌及其鞭毛、荚膜等明显可见。5 相差显微镜的临床应用
相差显微镜主要用于新鲜液体标本中细胞和微生物的检查,尤其适用于活细胞检查。一般是取新鲜液体标本,加上盖玻片(如用油镜时,还需在盖玻片上滴加镜油。)立即进行检验。当前相差显微镜主要用于以下几个方面:5.1 血液学检验 用于血小板计数、血液中寄生虫检查和某些活细胞观察等。血小板体积小而透明,一般光学显微镜10,6.3 光程(opticalpath) 光在不同的介质中经过相同的路径所用的时间不同,光在介质中传播的路径与对应介质的折射率的乘积称为光程。
6.4 光的干涉(interferenceoflight) 如果有两束光波,其频率、振动方向相同(并有恒定的位相差),当它们相遇时,如果两者的波峰与波峰、波谷与波谷叠加在一起,起到相互加强的作用,其合成(结合)波的振幅加强;相反,如果一个光波的波峰与另一光波的波谷相遇,则两者相互抵消,其合成波的振幅削弱。此种现象称为光的干涉。能产生干涉的两束光波称为相干光(coherentlight)。
6.5 光的振幅(amplitudeoflight) 在振动过程中,振动的物理量偏离平衡位置的最大值;光的强度与其振幅的平方成正比。参考文献:
[1]龚尔璋,甘平.医用物理学[M].北京:科学出版社,2001.177-232.
[2]Olympus:Instructionmanualforphasecontrastequipment.Olympus
OpticalCo.Tokyo,Japan.
[3]PrescottLM,HarleyJP,KleinDA.Microbiology[M].4thed.Bos-ton:McGraw-Hil,l1999.21-23.
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agnosis[M].6thed.SaintLouis:MosbyCo,1963.8-10.
[5]MichealBS,MartinS,LucasL.Phasecontrastmicroscopy:Applica-tion,Principle,andEquipment.In:Stiene-MartinEA,Lotspeich-SteiningerCA,KoepkeJA.ClinicalHematology[M].2nded.Phile-delphia:Lippincott,1998.42-43.
[6]朱忠勇.科学与严谨是检验医学的灵魂[J].中华检验医学杂志,
2005,28(11):1106-1108.
(本文编辑:陈军)
编者按:目前国内相差显微镜十分普及,但很多基层医疗单位的检验人员对相差显微镜的原理、结构及实际应用都不甚
了解。本刊约请朱忠勇教授和朱晓辉主任撰写了本文,希望能对基层工作者有所帮助。我们也欢迎其他专家就医学检验中有关的基本理论和技术撰写深入浅出的知识讲座,为提高一线检验人员的专业水平而热情赐稿。
(收稿日期:2007-02-25)
文章编号:1001-764X(2007)04-0310-01 中图分类号:R446.11 文献标识码:B
#调查研究#
兰州市健康新生儿动脉血血细胞14项参数参考范围调查
赵翠生,何莉,张翀,董雪梅(甘肃省妇幼保健院,兰州730050)
关键词:健康新生儿;血细胞参数;调查
我们对兰州市1020名新生儿进行动脉血血细胞14项参数调查,旨在为本地区建立健康新生儿的血细胞分析参数的参考值范围。1 资料与方法
1.1 对象 2004~2006年在我院出生的健康新生儿1020例,男520例,女500例。出生时体重2500~3999克,胎龄37~42周,Apare评分\8分。无胎粪吸入综合征、先天畸形等疾病。
1.2 标本采集 出生24h内采集桡动脉血液2ml于含ED-TA-K2的真空采血管(美国BD公司)内,4h内完成测试。1.3 仪器、试剂 采用SysmexKX-21N自动血液分析仪,试剂为进口配套试剂。室内质控物采用Sysmex公司原装配套全血质控物。
1.4 统计学方法 用SPSS10.0统计软件处理,以¸x?1.96s为参考值范围。组间比较用单个独立样本均数的t检验。2 结果
2.1 1020名健康新生儿动脉血血细胞参数结果 见表1。表1 1020名新生儿血细胞14项参数参考范围(¸x?1.96s)
项目WBC(@10/L)RBC(@1012/L)Hb(g/L)HCT(L/L)MCV(fl)MCH(pg)MCHC(g/L)PLT(@109/L)L(%)M(%)N(%)LN
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儿脐血血细胞各参数正常参考范围已有报道[2-3],本文对新生儿桡动脉血血细胞各参数正常参考范围调查结果与国内参考书静脉血报道值比较表明:动脉血MCH、MCHC、PLT、N%明显偏高,
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Hb、HCT、RBC、MCV、WBC、L、M、N、L%、M%均显著偏低。男、女新生儿各项参数结果差别无统计学意义。
本调查结果提醒临床医生在分析检验报告时应根据新生儿的日龄、标本采集部位、地区、种族、实验室采用的仪器参阅该实验室自己的参考范围。
表2 本调查动脉血与国内参考书(静脉血)结果比较
项目HbHCTRBCMCVMCHMCHCPLTWBCN#L
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本调查均值1780.484.6310537.435523615.7
范围146~2100.38~0.533.61~5.6499~11234~41327~383226~34610.7~20.7
均值1840.585.8010835.033019218.111.0
5.501.550.610.31
参考书
范围
t值P值
140~220-4.35
-26.4
100~2609~30
12.4
男性10.3~20.73.60~5.60147~2100.38~0.5398~11235~40324~388122~3460.068~0.400
0.014~0.1340.532~0.860.78~5.960.43~1.634.39~14.2
女性11.2~20.83.61~5.69145~2100.38~0.53100~11133~42330~378129~3490.068~0.395
0.02~0.1290.536~0.860.81~6.040.59~1.594.58~15.9
合计10.7~20.73.61~5.64146~2100.38~0.5399~11234~41327~383226~3460.068~0.398
0.017~0.1320.534~0.860.80~6.000.52~1.604.49~15.05
9.774.49~15.05
3.450.8~6.01.06
0.52~1.60
0.6970.534~0.860.2330.068~0.398
6.0~26.0-4.7
2.0~11.0-22.7
13.5
M#
N(%)L%M%
0.0740.017~0.1320.086
参考文献:
[1]金汉珍.《实用新生儿学》[M].第二版.北京:人民卫生出版社,
1996.833-841.
[2]王树琴,丛玉隆,梁国威,等.2135例正常儿童静脉血血细胞参数
正常参考范围调查[J].中华医学检验杂志,1998,21(2):112-113.
[3]钟燕芳,廖灿,李秋明,等.胎儿血生理指标检测及在产前诊断的
研究[J].中国优生与遗传杂志,2005,13(8):57-58.
M#
#
2.2 本调查结果与国内参考书[1]结果比较 见表2。3 讨论
血液分析指标的正常参考范围因种族、群体、年龄、性别的不同而有所变化。国内有关儿童、成人静脉血、孕18~39周胎
(收稿日期:2006-12-18,修回日期:2007-02-28)
(本文编辑:陈军)