氟苯尼考及其与多西环素联合的体外抗菌作用
胡功政1,苑 丽1,刘智明2,王升运1,王付民1 (河南农业大学农业生物技术重点实验室,
河南郑州450002;2.河南省畜牧局)
摘要:对氟苯尼考(Florfenicol)及其与多西环素(Doxycycline)联合的体外抗菌活性、杀菌动力学曲线和抗菌后效应(PAE)作了研究。结果表明:氟苯尼考对鸡大肠杆菌等9种标准菌株最小抑菌浓度(MIC)为0.2～1.6mg/L,与氯霉素相似或略低,比甲砜霉素低1/2～1/80;对耐氯霉素、甲砜霉素的鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和猪大肠杆菌临床分离株仍有较强抗菌作用;对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌动力学曲线与甲砜霉素相似,表现为低浓度抑菌(小于4MIC值)、高浓度缓慢杀菌;对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的PAE显著长于甲砜霉素(P
中图分类号:S859.79 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2004)04-0379-04 氟苯尼考(Florfenicol)是动物专用的氯霉素类新型广谱抗生素。它以甲砜基取代氯霉素分子结构中的硝基,消除了不可逆性致再生障碍性贫血的毒副作用;以氟基取代甲砜霉素分子结构中A-甲基位上的羟基(细菌产生耐药性的主要结合位点[1,2]),不仅抗菌活性增强,而且对大部分耐氯霉素和甲砜霉素的菌株仍有活性[3,4]。氟苯尼考在畜禽及鱼细菌病防治上的研究应用逐渐增多,但由于价格高、用量大,在一定程度上限制了其临床应用。联合用药是克服不同抗菌药物抗菌范围局限,发挥协同作用以减少用量和使用成本的有效途径。目前,国内外对氟苯尼考的药效学研究主要是单药的体外抗菌活性和临床应用[5～8],尚未见氟苯尼考与多西环素(Doxycy-本试验旨在通过观察氟苯尼cline)联合抗菌作用的研究报道。
考及其联合用药的体外抗菌活性、杀菌动力学特点和体外抗
菌后效应(postantibioticeffect,PAE),为氟苯尼考复方制剂的研制及临床合理配伍使用提供科学依据。
1.4 体外抑菌试验
1.4.1 单药体外抑菌试验 分别无菌精确称取一定量药物,配制成1280mg/L的贮备液,采用试管2倍稀释法测定(3重复)最小抑菌浓度(MIC)[9],菌悬液浓度为105CFU/mL。以培养18～24h后能抑制细菌生长的最小药物浓度为MIC,继续培养到48h并将能抑制细菌生长最小药物浓度的前后2管接种普通琼脂平板,以菌落数≤5个的最小药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。
1.4.2 联合用药的体外抗菌活性 用棋盘法测定氟苯尼考与多西环素联合的体外抗菌活性。(1)单独用药组:将各浓度药物(2.5、5、10、20、40MIC)0.2mL加至1.6mL营养肉汤中,再加入菌悬液(106CFU/mL)0.2mL;(2)联合用药组:分别将2药的各浓度药物0.2mL分别加至1.4mL营养肉汤中,再加入菌悬液(106CFU/mL)0.2mL,使各管中的药物最终浓度分别为0.25MIC、0.5MIC、1MIC、2MIC和4MIC。另设阳性对照。每菌株重复棋盘试验3次。试验结果以部分抑菌浓度(FIC)指数作为联合药敏试验的判断依据[10]:FIC≤0.5为协同作用;0.52为拮抗作用。
1.5 杀菌动力学曲线 取1mL10MIC(或20、40、80MIC)的氟苯尼考或甲砜霉素药液,加入8mL37℃预温的营养肉汤中(其中对照组为9mL营养肉汤),混匀后加入106～107CFU/mL对数生长期菌悬液1mL,立即置37℃恒温水浴中培养,分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8h取0.1mL培养液进行细菌计数(重复3次取均值)。以各时间点CFU/mL值的常用对数(log10)为纵轴,以孵育时间(h)为横轴,绘出不同浓度下氟苯尼考单药、甲砜霉素单药及氟苯尼考与多西环素联合(1∶2)用药的杀菌动力学曲线,并根据图形报告协同、无关或拮抗作用[10](其中联合杀菌速率明显大于单药杀菌速率的较大值为协同;相近为无关;比单药杀菌速率的较大值小为拮抗)。1.6 体外PAE测定 分别取20MIC(或40、80MIC)的药液各0.2mL与1.8mL浊度为107～108CFU/mL对数生长期的菌悬液置3支试管中,此为试验管(T),同时设C1、C221 材料与方法
1.1 药品 氟苯尼考原粉,浙江台州海翔医药化工有限公司生产,含量为98%,批号:000408;氯霉素原粉,东北制药厂生产,含量为98%;甲砜霉素原粉,山东省明发制药有限公司生产,含量为98%,批号:010723;盐酸多西环素,开封制药厂生产,含量为98.5%,批号:010124。
1.2 试剂 营养肉汤、麦康凯营养琼脂、营养琼脂、血琼脂平板、二甲基甲酰胺等。1.3 菌种 鸡大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌C79-13、金黄色葡萄球菌C56000、猪链球菌C55138、猪沙门氏菌C78-猪大肠杆51、菌C83914、猪巴氏杆菌C44-41、牛大肠杆菌C83921和鸭巴氏杆菌C48-57等9种冻干标准菌株,均购自中国兽药监察所;鸡大肠杆菌(焦作株)、鸡白痢沙门氏菌(漯河株)、猪大肠杆菌(郑州株),系经过鉴定的临床分离株,由河南农业大学牧医工程学院提供。
收稿日期:2003-05-01
:(),,
加,与单药PAE的较大值相近为无关,比单药PAE的较小值还小为拮抗[11]。
匀后,置37℃恒温水浴中培养2h。再取上述各试验管药物-细菌混合物及对照管C1、C2中的液体,用37℃预温的营养肉汤1000倍稀释除药,并在C2对照管中加入一定量的药物,使其中的药物浓度相当于80MIC试验管中被1000倍稀释后的药物浓度,作为非残留药物造成PAE的对照。以上各管混匀后,立即置37℃恒温水浴中孵育,计为重建后零时。于重建后0、1、2、3、4、5、6h,分别取菌液0.1mL进行细菌计数(重复3次求均值)。以各时间点CFU/mL值的常用对数(log10)为纵轴,以孵育时间(h)为横轴,建立对照管或试验管重建后恢复生长的动力学曲线,并计算出T、C,按公式PAE=T-C计算,其中T、C分别为试验管或对照管细菌的CFU/mL值高于重建后零时10倍(1log10CFU/mL)所需时间(h)。
分别测定氟苯尼考、甲砜霉素、多西环素单药及氟苯尼考与多西环素联合(1∶2)后各相应浓度的PAE,联合用药的PAE值比2药单用PAE之和延长1h以上为协同,相近为相
2 结果
2.1 体外抗菌活性
2.1.1 单独用药 氟苯尼考等对9种标准菌株有较强且相近的体外抗菌活性(表1)。氟苯尼考MIC为0.2～1.6mg/L,其体外MIC和MBC值相近(相等或为2倍),略优于氯霉素;除金黄色葡萄球菌和猪链球菌外,对其他标准菌株的体外抗菌活性明显优于甲砜霉素(强2～80倍)。氟苯尼考对革兰氏阳性菌的作用较多西环素弱,但对革兰氏阴性菌的抗菌作用较多西环素强2～40倍(对猪沙门氏菌除外)。氟苯尼考对耐氯霉素、甲砜霉素、多西环素的临床分离株仍有很强的抗菌作用,其MIC为0.8～1.6mg/L。
表1 氟苯尼考等对几种病原菌的体外MIC和MBC
菌 种鸡大肠杆菌O78金黄色葡萄球菌鸡白痢沙门氏菌
猪链球菌猪沙门氏菌猪大肠杆菌猪巴氏杆菌牛大肠杆菌鸭巴氏杆菌鸡大肠杆菌(焦作株)鸡沙门氏菌(漯河株)
猪大肠杆菌(漯河株)
氟苯尼考MIC1.60.80.40.20.81.60.81.60.41.60.81.6
MBC1.61.60.80.41.63.21.61.60.83.21.63.2
MIC1.60.80.40.41.61.60.80.80.8646432
氯霉素
MBC1.61.60.80.41.61.61.61.61.6>256>256>256
MIC640.83.20.4643.26.43.21.6128128128
甲砜霉素
MBC1281.63.20.86412.812.812.83.2>256>256>256
MIC3.20.01250.40.012564646.412.864161632
多西环素
mg/LMBC6.40.0250.80.02512.86425.625.612.864128>256
2.1.2 联合用药 氟苯尼考与多西环素联合对4种细菌均呈现无关作用(表2),FIC分别为1.5、1.5、1.5和2,对鸡大肠杆菌、猪链球菌和鸡白痢沙门氏菌,联合后氟苯尼考的
MIC值为单独MIC的1/2。
表2 氟苯尼考与多西环素联合的抗菌作用
鸡大肠杆菌
项 目
4
多西环素MIC4
210.50.250*
------2------氟苯尼考MIC
1------0.50.250*-----+
---+++
---+++
▲*
鸡白痢沙门氏菌氟苯尼考MIC
4------2------1------0.50.250*-----+
---+++
---+++
▲*
金黄色葡萄球菌氟苯尼考MIC
4------2------1------0.50.250*----++
---+++
---+++
▲*
猪链球菌氟苯尼考MIC
4------2------1------0.50.250*-----+
---+++
---+++
▲*
注:*氟苯尼考单药对照;**多西环素单药对照;▲阳性对照;-未长菌;+长菌
2.2 杀菌动力学曲线 鸡大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的体外生长曲线呈S型。金黄色葡萄球菌在营养肉汤中生长较慢,其log10(CFU/mL)增加1个单位需(1.38±0.21)h;鸡大肠杆菌生长较快,其log10(CFU/mL)增加1个单位仅需(0.81±0.11)h,两者在浊度达10CFU/mL后生长速度渐慢并逐渐趋于恒定。氟苯尼考与甲砜霉素具有相似的杀菌曲线(图1,2),表现为低浓度抑菌,高浓度缓慢杀菌,对鸡大肠杆菌的杀菌速率明显高于金黄色葡萄球菌(P
后细菌才逐渐恢复生长;等于或大于4MIC时呈缓慢杀菌,细菌数随作用时间的延长缓慢减少,在24h培养液仍澄清透明。对金黄色葡萄球菌,2药在高浓度(等于或大于4MIC)时均呈现先抑制而后杀菌的二项曲线特征,杀菌速率随着浓度的升高而不同程度的提高,氟苯尼考在4MIC时的杀菌速率要显著快于2MIC(P
1、2、4、8MIC的氟苯尼考分别与多西环素按1∶2混合,对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌速率与氟苯尼考单药,
中国兽医学报 2004年7月 第24卷 第4期 ChinJVetSci July2004 Vol.24 No.4MIC时,呈现协同作用;对金黄色葡萄球菌,在等于或大于4MIC时,才呈现协同作用(图3,4)
。
381
图3 4MIC
氟苯尼考与多西环素联合对鸡大肠杆菌的杀菌曲线
图1 氟苯尼考对鸡大肠杆菌O78
的杀菌曲线
图4 4MIC氟苯尼考与多西环素联合对金黄色葡萄球菌的杀菌曲线
2.3 体外PAE 氟苯尼考与甲砜霉素在2、4、8MIC浓度时,均对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生长短不等的PAE(表3),PAE值呈浓度依赖性,即随接触药物浓度的增大,PAE有增长的趋势,其中2MIC浓度各药产生的体外PAE与8MIC之间差异显著(P0.05)。氟苯尼考对同一种细菌的体外PAE
图2
氟苯尼考对金黄色葡萄球菌的杀菌曲线
显著长于甲砜霉素(P
h
氟苯尼考+多西环素(1∶2)1.47±0.04(氟3.2+多6.4)1.87±0.21(氟6.4+多12.8)2.00±0.08(氟12.8+多25.6)2.78±0.01(氟1.6+多3.2)3.06±0.03(氟3.2+多6.4)3.11±0.10(氟6.4+多12.8)
表3 氟苯尼考及其与多西环素联合(1∶2)的体外PAE
细 菌鸡大肠杆菌O78
药物浓度2MIC4MIC8MIC
金黄色葡萄球菌
2MIC4MIC8MIC
甲砜霉素0.27±0.02(128)0.50±0.04(256)0.83±0.15(6128)0.18±0.01(1.6)0.29±0.09(3.2)0.53±0.01(6.4)
氟苯尼考1.45±0.07(3.2)1.92±0.13(6.4)2.07±0.05(12.8)0.48±0.02(1.6)0.69±0.09(3.2)1.18±0.10(6.4)
注:表中( )内数值为药物的质量浓度(mg/L)
氟苯尼考与多西环素以1∶2混合对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外PAE,随着药物浓度的升高而增长(表3),均与单药PAE的较大值相近,即与单药相比呈现无关作用。多西环素按2、4、8MIC氟苯尼考的2倍即6.4、12.8、25.6mg/L分别对鸡大肠杆菌的PAE为(0.51±0.05)、(0.72±0.01)、(1.28±0.03)h;对金黄色葡萄球菌(3.2、6.4、12.8mg/L)的体外PAE分别为(2.39±0.02)、(2.91±0.01)、(3.01±0.04)h。
痢沙门氏菌和猪大肠杆菌临床分离菌株也有效。这与其化学结构有关[1～4,12]:用氟基(-F)取代甲砜霉素A-甲基位上的羟
基(-OH),不仅提高了抗菌活性,使之强于氯霉素,极大优于甲砜霉素,而且对耐氯霉素和甲砜霉素的大部分菌株仍有强的杀菌活性。
棋盘法测得氟苯尼考与多西环素联合用药对所测4种细菌均呈无关作用,但无拮抗作用,两药联合对鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和猪链球菌的部分抑菌浓度(FIC)值均为1.5,此时氟苯尼考的MIC值比其单独时减小了1/2,说明在治疗由这几种细菌感染时,两药联合可减少氟苯尼考的用量,这对该药的推广应用及复方制剂的研制具有重要意义。
3.2 杀菌动力学曲线 杀菌动力学曲线是指将细菌与一定浓度的药物接触,通过测定细菌菌落数目的变化来研究药物对细菌作用的动态变化规律,它直接反映了药物与细菌间的3 讨论
3.1 氟苯尼考对几种常见病原菌的抗菌活性 本试验结果
表明,氟苯尼考的抗菌谱较广,对鸡大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌和猪链球菌等常见革兰氏阴性、阳性菌有,
382中国兽医学报 2004年7月 第24卷 第4期 ChinJVetSci July2004 Vol.24 No.4
依据。参考文献:
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明显高于阳性菌,可能与其作用机制和细菌细胞壁的主要成分有关。氟苯尼考的作用机制是抑制细菌蛋白质的合成,所以药物必须首先进入细菌内部才能发挥作用。革兰氏阴性菌的细胞壁主要由磷脂组成,有利于脂溶性高的氟苯尼考通过;而革兰氏阳性菌细胞壁主要成分是黏肽,仅含有少量的磷脂,因此氟苯尼考对阴性菌的杀菌速率明显高于阳性菌。
氟苯尼考与多西环素按1∶2联合对不同细菌的杀菌动力学曲线虽有一定的差异,但对鸡大肠杆菌,两药在较低浓度(2MIC)时即呈协同作用;而对金黄色葡萄球菌,两药却在较高浓度(4MIC)时才呈协同作用。在实际应用中,由于药物浓度在动物机体内是一个动态的过程,即药物浓度随时间而发生变化,所以临床上可把两药以合适比例配合使用,以增加杀菌速率,提高疗效。
3.3 体外PAE 本试验结果表明,不同浓度的氟苯尼考与甲砜霉素在体外对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有不同程度的PAE(0.18～2.07h),其产生PAE的原因可能与抗菌作用机理有关,即PAE的时间代表了药物自核糖体结合部位解析出来所需要的时间[13]。据报道[13～15],氯霉素类药物对革兰氏阴性、阳性菌的PAE与氟喹诺酮类相当或稍短,如8MIC氯霉素对大肠杆菌标准株(ATCC25922)接触1h,其PAE为3h,对大肠杆菌的体内(20mg/kg)PAE为1.6h。本试验测得的PAE与这些报道不同,有以下几方面的原因:(1)诱导PAE的菌量、药物浓度及时间不同;(2)受试菌的菌株或亚型不同。因为在相同的条件下,相同的菌株不同的亚型能产生不等的PAE;(3)测定PAE的方法不同。
抗生素联用的PAE测定,与常用的联合药敏试验相比,不仅可以了解抗菌药物联用后抗菌作用的变动情况,而且还可反映抗菌药物的浓度、作用时间与抗菌效应之间的关系,有助于临床给药方案的设计。本试验表明,氟苯尼考与多西环素按1∶2联合对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的PAE与相应浓度的单药相比,均表现为无关作用,即联合用药产生的PAE与单用药PAE的较大值相近,如对鸡大肠杆菌,联合用药的PAE与氟苯尼考单药PAE相似,表明当两药配合用于治疗鸡大肠杆菌病时,给药间隔应参照单独使用氟苯尼考的给药间隔时间。
本研究还发现,氟苯尼考对鸡大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC、MBC值相近,但从杀菌动力学曲线、PAE测定看,其对鸡大肠杆菌的杀菌速率、杀菌活性强于对金黄色葡萄球菌,说明在观察药物的抗菌活性时,仅有MIC、MBC值测定是不够的,必须考虑其杀菌动力学曲线、PAE,才能为全面评价抗菌药药效学提供重要的参考依据,才能全面反映药物、细菌及宿主三者之间的关系,为设计最佳给药方案提供更为科学的
[13]
AntibacterialActivityofFlorfenicolandIt′sCombinationswithDoxycyclineInvitro
HUGong-zheng,YUANLi,LIUZhi-ming,WANGSheng-yun,WANGFu-min (1.KeyLaboratoryof AgriculturalBiotechnique,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;2.HenanAnimal HusbandryBureau)
Abstract:Antibacterialactivity,time-killingkineticcurveofflorfenicolandit′scombinationswithdoxycyclineinvitrowerestudied.Theresultsrevealedthatminimalinhibitoryconcentration(MICs)offlorfenicolagainstninecommonstandardstrains
1
1
2
1
1
中国兽医学报 2004年7月 第24卷 第4期 ChinJVetSci July2004 Vol.24 No.4383
氧氟沙星(Ofloxacin)在鲤鱼体内的药代动力学
张祚新1,张雅斌2,刘艳辉2,吴永魁1,李乾学1 (1.解放军军需大学军事兽医研究所,吉林长春130062;
2.吉林省水产科学研究所,吉林长春130033)
摘要:应用HPLC法测定了单次混饲口服氧氟沙星(10mg/kg)后,鲤鱼体内不同时间的血浆药物浓度。利用MCPKP药代动力学软件分析数据,其药代动力学特征符合一级吸收一室开放模型,动力学方程为C=3.29431(e-0.04341t-e-1.11474t)。主要药代动力学参数:吸收半衰期(T1/2ka)0.62167h,半衰期(T1/2k)15.96405h,最高血药浓度(Cmax)2.77589mg/L,出现最高血药浓度时间(TPP,血药浓度时间曲线下面积(AUC)72.934mg/L·h,血浆治疗浓度维持时间TCP(ther)5.4410h。结果表明,氧氟沙星在鲤鱼体内吸收较迅速,达峰时间较短,血药峰浓度高,消除缓慢,保持有效杀菌浓度时间长,适用于鱼类细菌性疾病的预防和治疗。
关键词:氧氟沙星;高效液相色谱;药代动力学;鲤鱼
中图分类号:S859 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2004)04-0383-03 氧氟沙星(Ofloxacin)为第3代氟喹诺酮类抗菌药,具有广谱、高效、低毒等特点。作为兽医临床上治疗细菌感染性疾病的常用药物,国内对其在人、家畜体内的药动学已有报道[3,4]。本试验对氧氟沙星在健康鲤鱼体内的药动学进行了研究,以为使用该药治疗鱼类细菌感染性疾病提供理论依据。
[1,2]
加入5mL乙腈旋涡快速混匀2min,3500r/min离心15min,吸取全部上清液于另一7mL离心管中,在70℃水浴中氮气流下吹干,再加入3mL乙腈,旋涡快速混匀2min,3500r/min离心10min,吸取全部上清液于另一7mL离心管中,在70℃水浴中氮气流下吹干,用流动相溶解,吸取20LL作HPLC分析。
1.4 标准曲线制作
1.4.1 对照品标准曲线制作 准确称取干燥恒重的氧氟沙星对照品0.1000g,用1%醋酸5mL溶解后,转移至100mL棕色容量瓶中,用超纯水稀释至刻度,1～4℃保存备用。取10mL棕色容量瓶11只,将氧氟沙星对照品母液按0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、16、32mg/L的质量浓度加入到10个容量瓶中,第1只不加药。取20LL作HPLC分析,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标做标准曲线,并求出回归方程和相关系数。
1.4.2 氧氟沙星血浆标准曲线 在11支5mL的具塞试管中各加入0.25mL空白血浆,再依次加入0.2mL氧氟沙星标准液系列(0.25～32mg/L),快速混匀2min,第1管不加药液,按1.3血浆样品处理后,准确加入流动相0.2mL溶解,快速混匀2min,待溶解后转移至1.5mL尖底具塞离心
1 材料与方法
1.1 药品与仪器 氧氟沙星标准品,纯度99.4%,批号Hyf020400,由中国兽药检察所提供;2%氧氟沙星溶液,市购。高效液相色谱仪Waters-Baseline-810,美国。1.2 试验动物 鲤鱼,体质量(95±8)g,试验前饲喂于45cm×50cm水族箱中,每箱2条,饲养温度(20±2)℃。1.3 血样采集与处理 氧氟沙星混于饲料中口服给药,剂量为10mg/kg。给药前采1次空白血浆(0h),给药后0.17、0.5、1、2、3、6、12、24、36、48、60h各采血1mL,分离血浆,冷冻保存备用。准确吸取血浆0.25mL,置于7mL离心管中,
收稿日期:2003-04-03
基金项目:吉林省科技发展计划项目(20000557) 作者简介:张祚新(1955-),男,实验师。
were0.2-1.6mg/L,slightlylowerthanorequaltothoseofchloramphenicolandlower2-80timesthanthoseofthiamphenicol,
andit′sMICsagainstclinicalisolatedstrainsresistanttochloramphenicolandthiamphenicolwere0.8-1.6mg/L.Thetime-killingkineticcurvesofflorfenicolagainstE.coliandS.aureus,weresimilartothoseofthiamphenicol,indicatingthebacterialgrowthwasinhibitedat1or2MICandgraduallykilledatboth4and8MIC.ThePAEsinducedbyantibioticsagainstE.coliandS.aureusweredeterminedbymeansofviablecountingprocedureaftertheremovalofdrugs.TheresultsdemonstratedthatPAEsdurationinducedbyflorfenicolwasmuchlongerthanthatofthiamphenicolandshowedconcentrationdependent,PAEs
1.18h).Thesensitiv-durationinducedbyflorfenicolagainstE.coli(1.45-2.07h)waslongerthanthatagainstS.aureus(0.48-itytestofflorfenicolagainstfourdifferentorganismswasconductedby“Chese-board”methodwhenitwascombinedwithdoxycycline(1∶2),andtheresultsillustratedthatthecombinationswereindifferenceagainstthefourtestedorganismsandfrationalinhibitoryconcentration(FICs)offlorfenicolplusdoxycycline(1∶2)againstE.coli,S.pullorum,S.suiswas1.5,thatistosaythatMICsofthesecombinationswerelower2timesthanthoseofflorfenicolalone,whenflorfenicolwascombinedwithdoxycycline(1∶2),thekillingrateofcombinationagainstE.coliandS.aureusincreasedascomparedwithitaloneandthetime-killingcurveshowedsynergisticat4MICofflorfenicolorhigher.AlthoughthePAEsofthecombinationswerealittlelongerthanthatofsinglesagainstthesameorganism,theyillustratedindifference.l;;-